免疫金技術(shù)課件

免疫金標(biāo)記技術(shù)第五組免疫金技術(shù)主要內(nèi)容一、免疫金技術(shù)的原理二、什么是膠體金三、膠體金的特點四、膠體金的制備五、膠體金的標(biāo)記六、膠體金的應(yīng)用七、膠體金在電鏡水平的應(yīng)用免疫金技術(shù)一、免疫金技術(shù)的原理免疫金技術(shù)是一種以膠體金作為標(biāo)記物的免疫標(biāo)記技術(shù)。本質(zhì)：蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。免疫金技術(shù)主要是利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法，這一反應(yīng)也可通過銀顆粒的沉積放大，成為免疫金銀染色。免疫金技術(shù)二、什么是膠體金膠體金是氯金酸在還原劑如：白磷、抗壞血酸、檸檬酸鈉和鞣酸等作用下，聚集成特定大小的金顆粒，由于靜電作用成為一種穩(wěn)定膠體狀態(tài)的水溶膠，具有高電子密度，在堿性環(huán)境中帶負(fù)電，能與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)借靜電吸引而形成牢固結(jié)合。膠體金顆粒由一個基礎(chǔ)金核(原子金Au)及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金屬表面的是內(nèi)層負(fù)離子，外層離子層則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸浮狀態(tài)。免疫金技術(shù)三、膠體金特點膠體金是一種帶負(fù)電荷的疏水膠體溶液，在溶液中金顆粒呈圓形，邊緣平滑，完整，界線清楚，因而有確定性。另一方面，膠體金的顆粒表面帶較多電荷，能對蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)進(jìn)行吸附結(jié)合，得到膠體金蛋白，在免疫化學(xué)或組織學(xué)中，吸附在膠體金表面的抗原或抗體能定向?qū)⒛z體金顆粒載運到組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原位置或固相載體上抗原、抗體的相應(yīng)位置，由于金顆粒具高電子密度的特性，且這些標(biāo)記物在固相載體上抗原抗體反應(yīng)處聚集達(dá)到一定密度時（10^7/mm)，出現(xiàn)肉眼可見的粉紅色斑點。所以其即可用于免疫電鏡、光鏡的抗原定位、定量和定性研究，也可作為指示物，用于體外免疫層析分析中檢測抗原或抗體存在。免疫金技術(shù)四、膠體金的制備根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來制備膠體金顆粒的方法如下。①白磷還原法②抗壞血酸還原法③檸檬酸三鈉還原法④硼氫化鈉還原法⑤鞣酸-檸檬酸鈉還原法(參考書上第146-147頁）免疫金技術(shù)五、膠體金標(biāo)記

1、概念抗原、抗體蛋白等生物大分子被吸附到膠體金表面的包被過程，稱膠體金標(biāo)記。

2、標(biāo)記吸附機理膠體金表面帶負(fù)電荷，在適宜的PH條件下，與蛋白質(zhì)分子的正電荷之間靠靜電吸引力相互吸引，達(dá)到范德華引力范圍內(nèi)，即形成牢固的結(jié)合。如果膠體金的PH低于蛋白質(zhì)等電點時，則會聚集失去結(jié)合能力。此外受膠體金的顆粒大小、離子濃度、蛋白質(zhì)及其相對分子質(zhì)量等因素影響。免疫金技術(shù)3、操作步驟如下：①待標(biāo)記蛋白質(zhì)預(yù)先以0.005mol/L(PH7.0)4℃透析過夜，除去鹽離子。②取出透析蛋白溶液，4℃10000g/min離心1h，取上清液，棄沉淀，去除聚合物。③用0.2mol/Lk2co3或0.1mol/LHCl調(diào)節(jié)膠體金的PH④根據(jù)待標(biāo)記蛋白質(zhì)的要求，調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH后，分裝10管，每管1mL。⑤將待標(biāo)記蛋白用PH9.0、0.005mol/L硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5~50ug/Ml,分別取1mL加入1管金溶膠液內(nèi)?；旌暇鶆?。免疫金技術(shù)⑥放置5min后，在上述各管內(nèi)加入0.1mL10﹪NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。（加入蛋白質(zhì)量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變，其中含蛋白質(zhì)量最低的試管即含穩(wěn)定1mL膠體金所需的蛋白質(zhì)量。在此基礎(chǔ)上在增加10﹪~20﹪，即為待標(biāo)記蛋白的實際用量。）⑦抗體蛋白的標(biāo)記，按上述方法確定兩種試劑的最適用量比例后，分別取所需用量的膠體金和相應(yīng)抗體蛋白，用0.1mol/L,k2CO3調(diào)至PH9.0.在攪拌下將膠體金和抗體蛋白混合，10min后加入一定量的穩(wěn)定劑(5﹪BSA)使其終濃度為1﹪至標(biāo)記物總量的1/10,以防止抗體蛋白和膠體金的聚合和發(fā)生沉淀。免疫金技術(shù)膠體金制備的注意事項（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。（2）試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45μm）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時，最好將整個小包裝一次性溶解。免疫金技術(shù)六、膠體金的應(yīng)用1、膠體金可用于標(biāo)記許多生物大分子，如：免疫球蛋白、卵白素、植物血凝素、脂蛋白、糖蛋白等。2、用膠體金可制備不同的免疫金探針。3、膠體金主要在電鏡水平的應(yīng)用。4、膠體金在光鏡水平的應(yīng)用。5、凝集實驗6、免疫印跡技術(shù)免疫金技術(shù)七、膠體金在電鏡水平的應(yīng)用1、膠體金在電鏡水平的研究最早，應(yīng)用最泛，其最大優(yōu)點是可以通過應(yīng)用不同大小的顆?；蚪Y(jié)合酶標(biāo)進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記。直徑為3~15nm膠體金均可用作電鏡水平的標(biāo)記物。3~15nm的膠體金多用于單一抗原的檢測，而直徑15nm多用于檢測量較多的感染細(xì)胞。2、膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：①細(xì)胞懸液或單層培養(yǎng)中細(xì)胞表面抗原的觀察。②單層培養(yǎng)