2025版高考生物二輪復(fù)習(xí)課件 課時(shí)2 賦予生物新的遺傳特性的基因工程

賦予生物新的遺傳特性的基因工程課

時(shí)2目

錄重點(diǎn)1基因工程和蛋白質(zhì)工程PCR技術(shù)及應(yīng)用重點(diǎn)2知識(shí)盤查曾經(jīng)這樣考重點(diǎn)1

基因工程和蛋白質(zhì)工程還會(huì)這樣考1.歸納基因工程的基本工具提醒若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，則能使目的基因和載體定向連接,避免自身環(huán)化和反向連接，提高連接的有效性。細(xì)胞和細(xì)胞產(chǎn)物磷酸二酯黏性磷酸二酯黏性2.理解掌握基因工程的操作步驟 (1)目的基因的篩選與獲取基因文庫(kù)PCR逆轉(zhuǎn)錄(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建——重組質(zhì)粒的構(gòu)建RNA聚合酶提醒①啟動(dòng)子和終止子：?jiǎn)?dòng)子(DNA片段)≠起始密碼子(位于mRNA上)；終止子(DNA片段)≠終止密碼子(位于mRNA)上。②目的基因插入位置：?jiǎn)?dòng)子與終止子之間。③利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物時(shí)，應(yīng)將目的基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動(dòng)子等調(diào)控元件重組在一起。(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法(4)目的基因的檢測(cè)與鑒定提醒PCR技術(shù)不僅可用于獲取和擴(kuò)增目的基因，還能用于檢測(cè)受體細(xì)胞中是否含有目的基因或受體細(xì)胞中的目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA?？乖贵w雜交抗性接種實(shí)驗(yàn)3.圖示法解讀蛋白質(zhì)工程基因合成

新的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

脫氧核苷酸序列1.(2023·新課標(biāo)卷，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。C下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(

)A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接解析酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接，A不符合題意；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)載體缺少標(biāo)記基因，無法進(jìn)行后續(xù)的篩選，D不符合題意。A2.(2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。利用L－谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ－氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如下圖方法將釀酒酵母S的L－谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導(dǎo)入生產(chǎn)菌株E.coliA，構(gòu)建了以L－谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是(

)A.圖中表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadBB.E.coliB發(fā)酵生產(chǎn)γ－氨基丁酸時(shí)，L－谷氨酸鈉的作用是供能C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒解析分析題意，可以從釀酒酵母S中篩選、分離出目的基因gadB，然后利用PCR擴(kuò)增目的基因，A正確；由題意知，L－谷氨酸鈉是生產(chǎn)γ－氨基丁酸的底物，不能用來供能，B錯(cuò)誤；將目的基因(gadB)導(dǎo)入菌株E.coliA構(gòu)建高效生產(chǎn)γ－氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ－氨基丁酸，C錯(cuò)誤；根據(jù)題干提供的信息，無法推斷出是否有其他酶能夠替代NcoⅠ和KpnⅠ，D錯(cuò)誤。B3.(2023·重慶卷，12)某小組通過PCR(假設(shè)引物長(zhǎng)度為8個(gè)堿基，短于實(shí)際長(zhǎng)度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(如下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A.實(shí)驗(yàn)所用引物，其中一個(gè)序列為5′－TGCGCAGT－3′B.步驟①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步驟①的酶對(duì)載體進(jìn)行酶切至少獲得了2個(gè)片段D.酶切片段和載體連接時(shí)可使用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶解析根據(jù)擴(kuò)增所得DNA片段可知，實(shí)驗(yàn)所用的兩種引物序列為5′－TGCGCAGT－3′和5′－AGCTAGCA－3′，A正確；根據(jù)酶切后得到的黏性末端判斷，步驟①所用酶是NheⅠ和CfoⅠ，B錯(cuò)誤；步驟①用兩種酶切割載體(質(zhì)粒)，質(zhì)粒上至少有兩個(gè)切口，至少產(chǎn)生2個(gè)片段，C正確；目的基因片段和質(zhì)粒經(jīng)酶切后產(chǎn)生的均為黏性末端，可用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶連接，D正確。4.(2024·新課標(biāo)卷，35)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細(xì)菌(B1)的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(diǎn)(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如下圖所示，→表示引物5′→3′方向?；卮鹣铝袉栴}。(1)限制酶切割的化學(xué)鍵是______________。為保證N基因能在菌株B2中表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時(shí)，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，原因是__________________________________________________________________________________________________________________________。磷酸二酯鍵

保證N基因啟動(dòng)子、N基因、N基因終止子的完整性，確保N基因能夠順利表達(dá)(2)CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細(xì)菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對(duì)可以形成的堿基對(duì)有G—C和____________________。C—G、U—A、A—T(3)用引物P1和P2進(jìn)行PCR可驗(yàn)證片段甲插入了細(xì)菌B1基因組，所用的模板是____________________；若用該模板與引物P3和P4進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是_______________________________。菌株B2的基因組無PCR產(chǎn)物(4)與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈的優(yōu)點(diǎn)是___________________________________________________________________(答出2點(diǎn)即可)。無空氣污染；更安全，無火災(zāi)隱患；分解效率更高，高效利用秸稈資源等解析

(1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯鍵。由題述可知，該過程是將重組質(zhì)粒特定位點(diǎn)，接入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替換區(qū)(M1＋啟動(dòng)子＋N基因＋終止子＋M2)，再接入B1基因組中，得到B2，因此在M1和M2之間，需要保證N基因完整性，同時(shí)需要保證N基因能夠正常表達(dá)，因此需要把M1接入啟動(dòng)子之前，M2接入終止子之后。(2)根據(jù)所給信息，向?qū)NA需要與對(duì)應(yīng)DNA進(jìn)行結(jié)合，結(jié)合期間，RNA的堿基會(huì)和DNA的堿基進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則配對(duì)方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。(3)需要驗(yàn)證是否插入重組后的片段甲，因此所用模板為菌株B2的基因組，如果有PCR產(chǎn)物說明菌株B2中含有N基因，如果沒有PCR產(chǎn)物說明菌株B2中不含N基因。因?yàn)槠渭妆惶鎿Q，因此在重組片段甲(M1＋啟動(dòng)子＋N基因＋終止子＋M2)中，沒有引物P4的結(jié)合位置，因此使用引物P3、P4進(jìn)行PCR時(shí)，無法獲得PCR產(chǎn)物。(4)秸稈焚燒嚴(yán)重污染環(huán)境，且有很大的火災(zāi)隱患，與此同時(shí)，焚燒對(duì)于有機(jī)物中的能量是極大的浪費(fèi)，可以從上述角度進(jìn)行論述。例如：無空氣污染；更安全，無火災(zāi)隱患；分解效率更高，高效利用秸稈資源等。D1.(2024·九省聯(lián)考甘肅卷，15)胰島素可用于治療糖尿病，我國(guó)科學(xué)家打破國(guó)外技術(shù)壟斷，研發(fā)了擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組人胰島素藥物，下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A.用PCR技術(shù)擴(kuò)增人胰島素基因時(shí)，每次循環(huán)包括變性、復(fù)性、延伸三步B.構(gòu)建人胰島素基因表達(dá)載體時(shí)，需使用限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶C.大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)Ca2＋處理后，更容易吸收重組的人胰島素基因表達(dá)載體D.抗原－抗體雜交法不能檢測(cè)人胰島素基因表達(dá)載體是否導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞解析用PCR技術(shù)擴(kuò)增人胰島素基因時(shí)，擴(kuò)增的過程是：目的基因DNA受熱變性后解為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合；然后以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，即將4種脫氧核苷酸加到引物的3′端，如此重復(fù)循環(huán)多次。每次循環(huán)一般可以分為變性、復(fù)性和延伸三步，A正確；在構(gòu)建人胰島素基因表達(dá)載體時(shí)，首先用一定的限制性內(nèi)切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和載體，再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個(gè)重組DNA分子，B正確；大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)Ca2＋處理后，細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，更容易吸收重組的人胰島素基因表達(dá)載體，C正確；抗原－抗體雜交法可以檢測(cè)人胰島素基因是否在大腸桿菌中翻譯成胰島素，若抗原－抗體雜交結(jié)果為陽(yáng)性，說明人胰島素基因在大腸桿菌中表達(dá)，則可以說明人胰島素基因表達(dá)載體導(dǎo)入了大腸桿菌細(xì)胞中，D錯(cuò)誤。2.(2024·重慶市質(zhì)量檢測(cè))煙草是我國(guó)一些地區(qū)的經(jīng)濟(jì)作物之一，提高煙草質(zhì)量有利于提高經(jīng)濟(jì)收入。我國(guó)科研團(tuán)隊(duì)研究了一種轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種，抗鹽基因的結(jié)構(gòu)和獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種的過程(①～⑤)如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種過程中利用的生物技術(shù)有______________________________________________________(答出2項(xiàng))等。(2)為確保目的基因定向插入質(zhì)粒，應(yīng)該選擇限制酶________________切割含目的基因的DNA和質(zhì)粒。在培養(yǎng)基中加入____________(填“氨芐青霉素”或“四環(huán)素”)以便于重組DNA分子的篩選?；蚬こ碳夹g(shù)(或重組DNA技術(shù))、植物組織培養(yǎng)技術(shù)HindⅢ和SalⅠ氨芐青霉素(3)培育轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種的核心工作是圖中過程________(填序號(hào))。過程②③采用的方法是______________。(4)過程⑤需要用到_______________________等植物激素，在誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗的過程中，這兩種植物激素的比例會(huì)發(fā)生變化，原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗的過程中，需要誘導(dǎo)生成根、芽等不同組織，而當(dāng)生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值大時(shí)有利于根的分化，當(dāng)生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值小時(shí)有利于芽的分化解析

(1)①～③過程中利用了基因工程技術(shù)，煙草細(xì)胞→愈傷組織→轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草幼苗的過程中利用了植物組織培養(yǎng)技術(shù)。因此，獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種過程中利用的生物技術(shù)有基因工程技術(shù)、植物組織培養(yǎng)技術(shù)等。(2)抗鹽基因(目的基因)中含有限制酶BamHⅠ的切割位點(diǎn)，若用限制酶BamHⅠ切割含抗鹽基因的DNA，則會(huì)破壞抗鹽基因，因此不能用限制酶BamHⅠ切割含抗鹽基因的DNA；抗鹽基因兩端含有限制酶Sal

Ⅰ的切割位點(diǎn)，質(zhì)粒上也含有限制酶Sal

Ⅰ的切割位點(diǎn)，若用限制酶Sal

Ⅰ切割含抗鹽基因的DNA和質(zhì)粒，然后用DNA連接酶連接，則可能會(huì)造成質(zhì)粒和抗鹽基因自身環(huán)化，或者使抗鹽基因在質(zhì)粒中反向連接。因此應(yīng)該用兩種限制酶切割含抗鹽基因的DNA和質(zhì)粒，經(jīng)分析可知，可用限制酶HindⅢ、Sal

Ⅰ切割含目的基因(抗鹽基因)的DNA和質(zhì)粒，以確保目的基因定向插入質(zhì)粒。由于用限制酶HindⅢ、Sal

Ⅰ切割質(zhì)粒時(shí)，破壞了四環(huán)素抗性基因，而氨芐青霉素抗性基因沒有被破壞，因此應(yīng)在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素，以便于重組DNA分子的篩選。(3)基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，即圖中過程①。過程②③采用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(4)過程⑤是再分化，需要用到生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等植物激素。在誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗的過程中，這兩種植物激素的比例會(huì)發(fā)生變化，這是因?yàn)檎T導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗的過程中，需要誘導(dǎo)生成根、芽等不同組織，而當(dāng)生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值大時(shí)有利于根的分化，當(dāng)生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值小時(shí)有利于芽的分化。3.(2024·湖南雅禮中學(xué)調(diào)研)金屬硫蛋白(MT)是一類低分子量、富含半胱氨酸、具有金屬結(jié)合能力的普遍存在于生物體內(nèi)的金屬結(jié)合蛋白，具有多種生物學(xué)功能。近年來，因其與Zn、Cu、Cd等金屬的結(jié)合能力較強(qiáng)而用于生態(tài)修復(fù)?？蒲腥藛T成功地將人MT蛋白基因用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入番茄，成功培育轉(zhuǎn)基因番茄?；卮鹣铝袉栴}：注：T－DNA中標(biāo)出的啟動(dòng)子在真核細(xì)胞中表達(dá)。(1)感受態(tài)農(nóng)桿菌的制備：取保存的農(nóng)桿菌菌落用________接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，并置于________中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，完成菌種的活化和擴(kuò)大培養(yǎng)；取適量菌液置于CaCl2溶液中處理，制得感受態(tài)農(nóng)桿菌。(2)目的基因的獲取和轉(zhuǎn)化：取人肝臟細(xì)胞，破碎后提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物與Ti質(zhì)粒連接形成重組質(zhì)粒(如圖)，將其與制備好的感受態(tài)農(nóng)桿菌混合，使外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞；經(jīng)適宜條件培養(yǎng)一段時(shí)間，再加入適宜濃度的________篩選出轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。接種環(huán)搖床卡那霉素(3)轉(zhuǎn)化番茄：取番茄子葉進(jìn)行__________(填“消毒”或“滅菌”)處理后切段，再與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行共培養(yǎng)，一段時(shí)間后，取出子葉放在________上吸取多余菌液，再將子葉放在適宜的以___________培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(4)育成轉(zhuǎn)基因番茄：取上述處理的番茄子葉先經(jīng)________過程形成愈傷組織，將愈傷組織接種到含有特定激素的培養(yǎng)基上，就可以誘導(dǎo)其________成胚狀體，長(zhǎng)出________，進(jìn)而發(fā)育成完整的番茄植株。消毒無菌濾紙MS脫分化再分化芽和根(5)轉(zhuǎn)基因番茄性狀的檢測(cè)和生產(chǎn)應(yīng)用：為了檢測(cè)番茄中是否成功導(dǎo)入目的基因，可依據(jù)________________________設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)的同時(shí)應(yīng)以__________________________作為陰性對(duì)照，以導(dǎo)入Ti質(zhì)粒的番茄作為陽(yáng)性對(duì)照；已知某轉(zhuǎn)基因番茄植株能大量吸收Z(yǔ)n、Cd等，且這些金屬元素主要富集在根，生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)需對(duì)其定期拔除并實(shí)施無害處理，原因是__________________________________________________________________________________________________________________________(答出2點(diǎn)即可)。T－DNA片段的(部分)序列未導(dǎo)入Ti質(zhì)粒的野生型番茄

避免死亡后根等遺體被分解，Zn、Cd等再度返回土壤，造成二次污染；及時(shí)拔除植物后，可緩解Zn、Cd等隨食物鏈不斷富集的危害解析

(1)取保存的農(nóng)桿菌菌落用接種環(huán)接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，并置于搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，使其大量繁殖；取適量菌液置于CaCl2溶液中處理，制得感受態(tài)農(nóng)桿菌。(2)由圖可知，載體上含有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，但能在農(nóng)桿菌中表達(dá)的是卡那霉素抗性基因，因此，經(jīng)適宜條件培養(yǎng)一段時(shí)間，再加入適宜濃度的卡那霉素篩選出轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。(3)取番茄子葉進(jìn)行消毒處理，其目的是防止雜菌污染，而后切段，再與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行共培養(yǎng)，一段時(shí)間后，取出子葉放在無菌濾紙上吸取多余菌液，再將子葉放在適宜的以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得無菌的外植體。(4)取上述處理的番茄子葉先經(jīng)脫分化過程形成愈傷組織，再在特定培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以誘導(dǎo)其再分化為胚狀體，長(zhǎng)出芽和根，最后發(fā)育成完整的番茄植株。(5)為了檢測(cè)番茄中是否成功導(dǎo)入目的基因，可依據(jù)T－DNA片段的部分序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)的同時(shí)應(yīng)以未導(dǎo)入Ti質(zhì)粒的野生型番茄作為陰性對(duì)照，以導(dǎo)入Ti質(zhì)粒的番茄作為陽(yáng)性對(duì)照。已知某轉(zhuǎn)基因番茄植株能大量吸收Z(yǔ)n、Cd等，且這些金屬元素主要富集在根，生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)需對(duì)其定期拔除并實(shí)施無害處理，這樣可以避免死亡后根等遺體被分解，這些元素再度返回土壤，造成二次污染；同時(shí)及時(shí)拔除植物后，能緩解Zn、Cd等隨食物鏈不斷富集的危害。4.(2024·湖南卷，21)百合具有觀賞、食用和藥用等多種價(jià)值，科研人員對(duì)其進(jìn)行了多種育種技術(shù)研究?；卮鹣铝袉栴}：(1)體細(xì)胞雜交育種。進(jìn)行不同種百合體細(xì)胞雜交前，先用__________________去除細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體，使原生質(zhì)體融合，得到雜種細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)，常用____________________(填植物激素名稱)誘導(dǎo)愈傷組織形成和分化，獲得完整的雜種植株。纖維素酶和果膠酶生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素(2)單倍體育種。常用___________________________的方法來獲得單倍體植株，鑒定百合單倍體植株的方法是______________________________________________________________________________________________________________?；ㄋ?或花粉)離體培養(yǎng)

利用顯微鏡觀察根尖有絲分裂中期細(xì)胞中染色體的數(shù)目(3)基因工程育種。研究人員從野生百合中獲得一個(gè)抵抗尖孢鐮刀菌侵染的基因pL，該基因及其上游的啟動(dòng)子pL和下游的終止子結(jié)構(gòu)如圖a。圖b是一種Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中基因gus編碼GUS酶，GUS酶活性可反映啟動(dòng)子活性。①研究病原微生物對(duì)L的啟動(dòng)子pL活性的影響。從圖a所示結(jié)構(gòu)中獲取L，首先選用__________________酶切，將其與相同限制酶酶切的Ti質(zhì)粒連接，再導(dǎo)入煙草。隨機(jī)選取3組轉(zhuǎn)基因成功的煙草(P1、P2和P3)進(jìn)行病原微生物脅迫，結(jié)果如圖c。由此可知：三種病原微生物都能誘導(dǎo)pL的活性增強(qiáng)，其中________的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。HindⅢ、BamHⅠ交鏈格孢②現(xiàn)發(fā)現(xiàn)栽培種百合B中也有L，但其上游的啟動(dòng)子與野生百合不同，且抗病性弱。若要提高該百合中L的表達(dá)量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種，簡(jiǎn)要寫出實(shí)驗(yàn)思路______________________________________________________________________________________________________________________。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將百合B中L基因的啟動(dòng)子替換為野生百合中L基因的啟動(dòng)子pL解析

(1)因植物細(xì)胞細(xì)胞壁的成分主要是纖維素和果膠，因此獲得原生質(zhì)體的方法是用纖維素酶和果膠酶對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行處理，得到原生質(zhì)體后使原生質(zhì)體融合，形成雜種細(xì)胞，再用生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)愈傷組織形成和分化，從而獲得完整的雜種植株。(2)獲得單倍體植株的常用方法是花藥(花粉)離體培養(yǎng)；鑒定百合單倍體植株的方法是利用顯微鏡觀察根尖有絲分裂中期細(xì)胞中染色體的數(shù)目，如果染色體數(shù)目減少一半，則獲得的植株為單倍體植株。(3)①根據(jù)目的片段以及質(zhì)粒上限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，若要獲得pL并連接到質(zhì)粒上，可選用限制酶HindⅢ、BamHⅠ進(jìn)行酶切，以替換Ti質(zhì)粒中的啟動(dòng)子，從而達(dá)到根據(jù)GUS酶活性反映啟動(dòng)子活性的目的。根據(jù)圖c的結(jié)果可知，交鏈格孢的每一組轉(zhuǎn)基因煙草中的GUS酶活性都最高可確定其誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。②欲培育具有高抗病原微生物百合新品種，可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將百合B中L基因的啟動(dòng)子替換為野生百合中L基因的啟動(dòng)子pL。重點(diǎn)2

PCR技術(shù)及應(yīng)用知識(shí)盤查曾經(jīng)這樣考還會(huì)這樣考1.PCR技術(shù)原理與條件DNA半保留復(fù)制引物2.PCR技術(shù)的過程提醒可通過引物控制PCR擴(kuò)增的基因片段，并在基因兩側(cè)引入限制酶識(shí)別序列。復(fù)性72℃TaqDNA聚合酶3.DNA的粗提取與鑒定4.DNA片段的電泳鑒定D1.(2024·安徽卷，14)下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是(

) A.實(shí)驗(yàn)中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會(huì)降低 B.利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA C.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物 D.將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應(yīng)，可檢測(cè)溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)解析若將研磨液更換為蒸餾水，則從細(xì)胞核中釋放出的DNA量會(huì)減少，從而會(huì)降低DNA提取的效率，A正確；由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，所以利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA，B正確；DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液，利用該原理可純化DNA粗提物，C正確；二苯胺試劑可以用于鑒定DNA，不能檢測(cè)出溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，D錯(cuò)誤。D2.(2024·新課標(biāo)卷，5)某種二倍體植物的P1和P2植株雜交得F1，F(xiàn)1自交得F2。對(duì)個(gè)體的DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖所示，其中①～⑧為部分F2個(gè)體，上部2條帶是一對(duì)等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，下部2條帶是另一對(duì)等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，這2對(duì)等位基因位于非同源染色體上。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A.①②個(gè)體均為雜合體，F(xiàn)2中③所占的比例大于⑤B.還有一種F2個(gè)體的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果有3條帶C.③和⑦雜交子代的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與②⑧電泳結(jié)果相同D.①自交子代的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與④電泳結(jié)果相同的占1/2解析由題圖可知，P1、P2為純合子，F(xiàn)1為雜合子，且兩對(duì)等位基因的遺傳符合自由組合定律，假設(shè)基因由上到下依此為A、a、B、b，則P1基因型為AAbb，P2基因型為aaBB，F(xiàn)1基因型為AaBb，據(jù)此分析選項(xiàng)。①基因型為AaBB，②基因型為Aabb，均為雜合體；F2中，③基因型為AABb，占比1/8，⑤基因型為AABB，占比1/16，③占比大于⑤，A正確；據(jù)圖分析，圖中缺少F2中基因型為aaBb對(duì)應(yīng)的電泳圖像，其電泳結(jié)果為3條帶，分別為第2條帶、第3條帶和第4條帶，B正確；由題圖可知，③和⑦對(duì)應(yīng)雜交類型為AABb×aabb，因此后代基因型為AaBb、Aabb，與②(基因型為Aabb)、⑧(基因型為AaBb)電泳結(jié)果相同，C正確；①基因型為AaBB，其自交后代基因型及比例為AABB∶AaBB∶aaBB＝1∶2∶1，④的基因型為aaBB，因此①自交子代與④電泳結(jié)果相同的占比1/4，D錯(cuò)誤。D3.(2024·山東卷，5)制備熒光標(biāo)記的DNA探針時(shí)，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴(kuò)增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標(biāo)記的dATP)的反應(yīng)管①～④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA，已知形成的雙鏈DNA區(qū)遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，且在本實(shí)驗(yàn)的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的雙鏈DNA區(qū)。能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針的反應(yīng)管有(

)A.①② B.②③ C.①④ D.③④反應(yīng)管加入的單鏈DNA①5′—GCCGATCTTTATA—3′3′—GACCGGCTAGAAA—5′②5′—AGAGCCAATTGGC—3′③5′—ATTTCCCGATCCG—3′3′—AGGGCTAGGCATA—5′④5′—TTCACTGGCCAGT—3′4.(2023·江蘇卷，22)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運(yùn)用重組酶技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請(qǐng)回答下列問題：(1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有______________，擴(kuò)增程序中最主要的不同是______________。(2)有關(guān)基因序列如圖2。引物F2－F、F1－R應(yīng)在下列選項(xiàng)中選用________。EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC—GACGAGCTGTACAAG3′AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG—CCAAAACCACAACCA3′圖2A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCATC.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC模板、引物退火溫度CD(3)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過程相比，無需使用的酶主要有________________________________。(4)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯(cuò)誤的有________。A.稀釋涂布平板需控制每個(gè)平板30～300個(gè)菌落B.抗性平板上未長(zhǎng)出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高C.抗性平板上常常會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落D.抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落無需進(jìn)一步劃線純化限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶ABC(5)為了驗(yàn)證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計(jì)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板，用引物F1－F和F2－R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒P1～P4的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有________。(6)對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過基因測(cè)序確認(rèn)，原因是_____________________________________________________________________________________________。P3、P4電泳只能顯示擴(kuò)增片段的大致長(zhǎng)度，不能顯示精準(zhǔn)的DNA堿基數(shù)量，也不能呈現(xiàn)DNA堿基序列解析

(1)不同的PCR反應(yīng)體系中，模板和引物是不同的；擴(kuò)增程序中依據(jù)不同引物設(shè)置不同的退火溫度是最重要的環(huán)節(jié)，恰當(dāng)?shù)剡x擇退火溫度，盡量避免引物與模板的非特異性結(jié)合，以保證目的產(chǎn)物的有效擴(kuò)增。而對(duì)于延伸時(shí)間而言，以常用的TaqDNA聚合酶為例，催化DNA延伸的速度為1000～2000bp/min，通常在實(shí)驗(yàn)室中可根據(jù)目的片段大小在30s～2min的時(shí)長(zhǎng)內(nèi)大致設(shè)置延伸時(shí)間，一般不需要精確控制。(2)對(duì)于引物F2－F、F1－R，根據(jù)圖中信息分析，應(yīng)該包含EGFP尾部和AnB1頭部的序列，且反向互補(bǔ)。因此，應(yīng)選擇引物C和D。(3)根據(jù)圖中示意的同源重組過程，兩個(gè)插入片段與線性載體在重組酶作用下，可形成環(huán)狀質(zhì)粒，直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌，這一過程省去了傳統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建過程中酶切、連接兩個(gè)過程，所以無需使用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶。(4)“稀釋涂布平板需控制每個(gè)平板30～300個(gè)菌落”是微生物計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟，與抗性平板篩選的目的完全不同，A錯(cuò)誤；涂布平板時(shí)，培養(yǎng)基已凝固，不會(huì)燙死細(xì)菌，抗性平板上沒有出現(xiàn)菌落，最常見的原因是未能有效實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒構(gòu)建，或未能進(jìn)行有效轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致抗性平板上未長(zhǎng)出帶有抗性質(zhì)粒的菌落，B錯(cuò)誤；由于篩選平板中含有抗生素，在正常的無菌操作過程中，不會(huì)出現(xiàn)大量的雜菌污染，C錯(cuò)誤；單菌落無需進(jìn)行純化，如攜帶非目標(biāo)質(zhì)粒，可通過鑒定排除，D正確。(5)結(jié)合圖1中的設(shè)計(jì)目標(biāo)，從PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷：P3無目的片段，P4產(chǎn)物片段大小不符，故P3、P4可直接丟棄。而P1、P2產(chǎn)物大小與理論值相近，需進(jìn)一步分析確認(rèn)。(6)電泳條帶依據(jù)其和參照分子(Marker)的相對(duì)位置，僅能顯示擴(kuò)增片段的大致長(zhǎng)度，即不能顯示精準(zhǔn)的DNA堿基數(shù)量，也不能呈現(xiàn)DNA堿基序列，必須通過DNA測(cè)序最終確認(rèn)構(gòu)建的質(zhì)粒符合設(shè)計(jì)。1.(2024·華師一附中調(diào)研)中天楊是由我國(guó)科學(xué)家采用生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，歷經(jīng)8年時(shí)間培育成功的抗鹽堿、耐干旱的楊樹新品種。該品種以八里莊楊為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)轉(zhuǎn)mtl－D基因培育獲得。如圖為培育“中天楊”的操作流程，①～⑥表示操作過程，該過程中可能用到的限制酶如表所示。注：Ti質(zhì)粒中的Tetr為四環(huán)素抗性基因，Ampr為氨芐青霉素抗性基因。(1)過程①需要的酶是______________________________，過程②需要的工具酶是____________________。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，在PCR反應(yīng)體系需加入引物，引物的作用是______________________________________________，若目的基因擴(kuò)增3代，則共用引物________個(gè)。PCR完成以后，常采用_________________法來鑒定PCR的產(chǎn)物。限制酶Bcl

ⅠEcoRⅠXba

ⅠSau3AⅠBamHⅠ切割位點(diǎn)T↓GATCAG↓AATTCT↓CTAGA↓GATCG↓GATCC逆轉(zhuǎn)錄酶和耐高溫的DNA聚合酶限制酶和DNA連接酶使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸14瓊脂糖凝膠電泳(2)培育轉(zhuǎn)基因楊樹的核心工作是___________________，在進(jìn)行該工作時(shí)，應(yīng)在mtl－D基因的兩側(cè)添加限制酶_________________的識(shí)別序列。(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞除圖示方法外，還有_______________。為了確認(rèn)目的基因在植物細(xì)胞中是否成功表達(dá)，從分子水平通常是用________________法進(jìn)行檢測(cè)?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建XbaⅠ、BclⅠ花粉管通道法抗原—抗體雜交解析

(1)過程①以RNA為模板合成DNA并進(jìn)行PCR，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶和耐高溫的DNA聚合酶。過程②是將目的基因與Ti質(zhì)粒進(jìn)行連接，需要限制酶切割目的基因和Ti質(zhì)粒，然后利用DNA連接酶將二者進(jìn)行連接。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，在PCR反應(yīng)