DB21T 3794-2023 水質(zhì) 底棲動(dòng)物鑒定 DNA條形碼法　

ICS13.060.99DB21水質(zhì)底棲動(dòng)物鑒定DNA條形碼法WaterQuality—IdentificationofMacrobenthos—DNABarcoding2023-08-30發(fā)布遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/T3794—2023 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4縮略語(yǔ) 5方法原理 6試劑和材料 7儀器和設(shè)備 8樣品 9分析步驟 10結(jié)果計(jì)算 11質(zhì)量保證與質(zhì)量控制 12廢物處理 13注意事項(xiàng) 附錄A（資料性）序列搜索與比對(duì) 9附錄B（資料性）進(jìn)化樹的構(gòu)建與遺傳距離的計(jì)算 11 DB21/T3794—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由遼寧省生態(tài)環(huán)境廳提出并歸口。本文件起草單位：遼寧省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心。本文件主要起草人：丁振軍、李楊、姜永偉、王星蒙、問青春、王秋麗、張爽、胥學(xué)鵬、張崢、盧雁。本文件為首次發(fā)布。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省生態(tài)環(huán)境廳（遼寧省沈陽(yáng)市渾南區(qū)雙園路30甲聯(lián)系電話文件起草單位通訊地址：遼寧省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心（遼寧省沈陽(yáng)市渾南區(qū)雙園路30甲-3聯(lián)系電話1DB21/T3794—2023水質(zhì)底棲動(dòng)物鑒定DNA條形碼法警告：EB溶液具有遺傳毒性，操作時(shí)應(yīng)按規(guī)定要求佩戴防護(hù)器具，避免接觸皮膚和衣物。本文件規(guī)定了利用DNA條形碼技術(shù)鑒定底棲動(dòng)物的方法。本文件適用于河流、湖泊和水庫(kù)中底棲動(dòng)物的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T30989高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程HJ710.8生物多樣性觀測(cè)技術(shù)導(dǎo)則淡水底棲大型無脊椎動(dòng)物T/CSES81淡水生物監(jiān)測(cè)環(huán)境DNA宏條形碼法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1底棲動(dòng)物macrobenthos指生活史的全部或至少一個(gè)時(shí)期棲息于水體底部或底部基質(zhì)中的不能通過0.5mm（40目）孔徑網(wǎng)篩的無脊椎動(dòng)物。[來源：HJ710.8-2014，3.2，有修改]3.2細(xì)胞色素c氧化酶亞基IcytochromecoxidasesubunitI，COI后生動(dòng)物線粒體基因組上的線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I對(duì)應(yīng)的DNA序列。[來源：T/CSES81-2023，3.7，有修改]3.3引物primer在DNA復(fù)制過程中，結(jié)合于模板鏈上并作為復(fù)制延伸的起始位點(diǎn)和/或終止位點(diǎn)的，具有一定長(zhǎng)度和順序的寡核苷酸鏈。[來源：GB/T30989-2014，3.11]3.4退火annealing模板雙鏈DNA經(jīng)熱變性、雙螺旋解開成單鏈后，通過緩慢冷卻到特定溫度，使引物與該模板DNA2DB21/T3794—2023單鏈重新配對(duì)，形成新的雙鏈分子的過程稱為退火。3.5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction，PCR模板DNA先經(jīng)高溫變性為單鏈，在DNA聚合酶和適宜的溫度下，兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以四種dNTP為底物，使退火引物得以延伸，如此反復(fù)變性、退火和DNA合成這一循環(huán)，使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增。[來源：GB/T30989-2014，3.14]3.6降落PCRtouchdownPCR，TDPCR一種退火溫度逐漸降低的多循環(huán)PCR反應(yīng)程序。由于前期退火溫度高，引物結(jié)合難度增大，錯(cuò)配幾率降低，目的片段的產(chǎn)率較低但準(zhǔn)確率較高。后期隨著退火溫度的降低，前期積累的正確目的片段會(huì)被大幅擴(kuò)增，使最終產(chǎn)物中目的片段的特異性大幅提高。3.7序列比對(duì)sequencealignment指運(yùn)用特定的算法檢測(cè)兩個(gè)或多個(gè)序列之間的相似性，用于發(fā)現(xiàn)生物序列中的功能、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化的信息。3.8遺傳距離geneticdistance遺傳距離指不同的種群或種之間的基因差異的程度，并以數(shù)值進(jìn)行度量。3.9生物大分子序列比對(duì)搜索工具BasicLocalAlignmentSearchTool，BLAST一種基于局部比對(duì)算法的搜索工具，可將輸入的核酸或蛋白質(zhì)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，獲得序列相似度等信息，從而判斷序列的來源或進(jìn)化關(guān)系。3.10分子進(jìn)化遺傳分析工具M(jìn)olecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，MEGA一種用于分析物種親緣關(guān)系、分子功能、遺傳進(jìn)化等的工具?？梢詫?shí)現(xiàn)序列比對(duì)和調(diào)參建樹等功能。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。EB——溴化乙錠（Ethidiumbromide）DNA——脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）COI——細(xì)胞色素氧化酶亞基I（cytochromecoxidasesubunitI）PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）BLAST——生物大分子序列比對(duì)搜索工具（BasicLocalAlignmentSearchTool）MEGA——分子進(jìn)化遺傳分析工具（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）DB21/T3794—20235方法原理酚作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)變性，SDS將細(xì)胞裂解，蛋白酶K消化蛋白質(zhì)成多肽，使DNA從蛋白質(zhì)中游離出來。DNA易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，離心后有機(jī)相在下層，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間，從而分離得到總DNA。PCR反應(yīng)可特異性的擴(kuò)增正向引物和反向引物間的序列，經(jīng)35次循環(huán)，目標(biāo)COI序列可被擴(kuò)增約235倍。與DNA結(jié)合的EB會(huì)被紫外光激發(fā)發(fā)出強(qiáng)烈的橙紅色熒光，比未結(jié)合的EB熒光強(qiáng)度高幾十倍，從而擴(kuò)增的COI序列可被檢測(cè)到。獲得的COI序列經(jīng)測(cè)序在NCBI或BOLD等公共數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相似序列。將測(cè)序結(jié)果與搜索得到的序列一起繪制NJ進(jìn)化樹并計(jì)算遺傳距離，一般遺傳距離小于0.02cM的認(rèn)為是同一種。DNA條形碼法鑒定底棲動(dòng)物流程圖見圖1。 圖1DNA條形碼鑒定底棲動(dòng)物流程圖6試劑和材料6.1無菌水：去離子水121℃滅菌。6.2無水乙醇（C2H6O）。6.370%乙醇。6.4乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA，C10H14N2O8Na2·2H2O）。6.5三羥甲基氨基甲烷（Tris，C4H11NO3）。6.6十二烷基硫酸鈉（SDS，C12H25SO4Na）。6.710%SDS溶液：稱取SDS10g，加入約60mL去離子水，加熱溶解，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，去離子水定容至100mL，常溫備用。6.8三氯甲烷（CHCl3）。6.9Tris飽和酚溶液（pH7.7～8.1，市售）。6.10蛋白酶K溶液：400U/mL（市售）。6.11EB儲(chǔ)存液：10mg/mL（市售）。6.12EB工作液：吸取10μLEB儲(chǔ)存液加入200mL去離子水中，混勻，終濃度為0.5μg/mL。6.13瓊脂糖（標(biāo)準(zhǔn)熔點(diǎn)）。4DB21/T3794—20236.141%瓊脂糖凝膠：稱取0.3g瓊脂糖，加入30mL去離子水，微波爐加熱至恰好全部熔化，立即倒入制膠槽中，插入制膠梳，臨用現(xiàn)制。可根據(jù)制膠槽大小適當(dāng)調(diào)整瓊脂糖凝膠的制備量。6.151×TE緩沖液：pH緩沖范圍7.5～8.5（市售）。6.1650×TAE緩沖液（市售）。6.171×TAE緩沖液：取20mL50×TAE緩沖液，去離子水定容至1L，常溫備用。pH緩沖范圍7.8～8.8。6.186×蔗糖凝膠上樣緩沖液：含溴酚藍(lán)、EDTA（市售）。6.192×TaqPCRMix預(yù)混液：含TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR緩沖液和溴酚藍(lán)（市售）。6.20DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（含上樣緩沖液，市售100bp～2000bp，包含6條單一DNA條帶，分別為：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。6.21PCR引物：LCO1490（GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGHCO2198（TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA）。7儀器和設(shè)備7.1天平：準(zhǔn)確到0.001g。7.2干式恒溫器：56℃可調(diào)。7.3PCR儀：PCR反應(yīng)程序可編輯。7.4水平電泳儀：電壓100V可調(diào)。7.5離心機(jī)：12000r/min可調(diào)。7.6凝膠成像儀：具有紫外成像功能。8樣品8.1樣品采集底棲動(dòng)物的采集按照HJ710.8相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。8.2樣品保存底棲動(dòng)物樣品采集后，用無水乙醇沖洗干凈，保存于無水乙醇中，冷凍條件下可長(zhǎng)期保存?，F(xiàn)場(chǎng)無冷凍條件的，應(yīng)4℃冷藏保存并盡快送到實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)為冷凍保存，冷藏條件保存不應(yīng)超過3天，以防DNA發(fā)生分解。9分析步驟9.1總DNA的提取組織樣本宜取自底棲動(dòng)物肌肉部位，該部位線粒體豐富，易于獲得較好的擴(kuò)增效果?？蛇x取底棲動(dòng)5DB21/T3794—2023物個(gè)體腿部或胸部組織，如底棲動(dòng)物個(gè)體較?。ㄈ鐡u蚊幼蟲可將整個(gè)個(gè)體放入EP管中進(jìn)行總DNA提取。取約25mg組織樣本，用無水乙醇反復(fù)清洗數(shù)次，濾紙吸干，放入1.5mLEP管中，加入500μLTE緩沖液（6.15100μL10%SDS溶液（6.720μL蛋白酶K（6.1056℃恒溫2h～4h至完全消化，消化前期應(yīng)不時(shí)搖晃EP管，使管內(nèi)溶液混勻。消化完成后，加入Tris飽和酚（6.9）600μL，混勻10min，12000r/min離心10min。取上清液加入1/2體積的三氯甲烷（6.8）、1/2體積的Tris飽和酚，混勻10min，12000r/min離心10min。取上清液加入相同體積的三氯甲烷，混勻10min，12000r/min離心10min。取上清液加入2倍體積的預(yù)冷至4℃的無水乙醇，-20℃沉淀1h～2h，12000r/min離心10min，小心倒掉上清液。使用預(yù)冷至4℃的70%乙醇400μL清洗雜質(zhì)，輕微搖晃1min，12000r/min離心2min，棄去上清液。再次使用預(yù)冷的70%乙醇400μL清洗雜質(zhì)，12000r/體積的三氯甲烷、-20℃沉淀存圖2總DNA提取流程圖也可使用市售試劑盒提取總DNA，具體操作步驟參照試劑盒使用說明書。建議優(yōu)先選用市售試劑盒提取。9.2總DNA的電泳檢測(cè)提取的總DNA應(yīng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以判斷總DNA提取情況。1%瓊脂糖凝膠（6.14）制備完成后連同制膠槽一同放入電泳槽TAE緩沖液中，上樣孔放置于電泳儀6DB21/T3794—2023負(fù)極方向，并使緩沖液液面略微超過凝膠上表面。吸取2.5μLDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（6.20）小心加入到第一個(gè)上樣孔中；總DNA樣品和6×蔗糖凝膠上樣緩沖液（6.18）按5:1混合均勻，吸取2.5μL混合后的樣品加入空上樣孔中。計(jì)算電泳槽正負(fù)極間的距離，調(diào)節(jié)電泳儀，使電壓不超過5V/cm～8V/cm。開始電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)染料條帶移動(dòng)至凝膠約2/3位置時(shí)，電泳結(jié)束。9.3EB染色將結(jié)束電泳的瓊脂糖凝膠從制膠槽中取出，放入EB染色液（6.12）中，使EB染色液沒過凝膠，染色30min。取出后清水漂洗兩次。注：也可使用其他染料替代EB，具體使用方法參見相關(guān)試劑說明書。9.4總DNA的凝膠成像將染色并漂洗后的凝膠放入凝膠成像儀中，紫外成像拍照，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，提取的總DNA大小一般大于2000bp。9.5PCR擴(kuò)增此階段共30次循環(huán)；再以45℃為退火溫度循環(huán)5次。整個(gè)PCR過程共計(jì)35次循環(huán)。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序見表1和表2。表1PCR反應(yīng)體系12324257DB21/T3794—2023表2PCR反應(yīng)程序54——9.6擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物按步驟9.2進(jìn)行電泳檢測(cè)。9.7EB染色擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)束后按步驟9.3進(jìn)行EB染色。9.8PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠成像染色并漂洗后的凝膠按步驟9.4進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠成像分析。9.9測(cè)序擴(kuò)增的COI序列可委托專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果文件為fasta格式。10結(jié)果計(jì)算10.1序列搜索與比對(duì)測(cè)試樣品的測(cè)序結(jié)果在NCBI等國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST搜索相似序列，一般要求相似性大于95%，將搜索得到的一條或多條相似序列與測(cè)序結(jié)果一起在MEGA等軟件中進(jìn)行序列比對(duì)（附錄A）。10.2繪制NJ進(jìn)化樹并計(jì)算遺傳距離比對(duì)完成后的結(jié)果使用Kimura2-parameter（K2P）模型，自展值（Bootstrap）不低于1000，繪制NJ進(jìn)化樹，計(jì)算遺傳距離（附錄B）。10.3結(jié)果判讀若進(jìn)化樹上測(cè)試樣品與搜索得到的序列聚為一支，且遺傳距離小于0.02cM，即可判定測(cè)試樣品與該序列為同一物種。11質(zhì)量保證與質(zhì)量控制11.1實(shí)驗(yàn)前的分類鑒定每次實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先對(duì)物種進(jìn)行目或科的簡(jiǎn)單分類鑒定。11.2平行樣的測(cè)定每次實(shí)驗(yàn)需開展平行雙樣測(cè)試，兩次鑒定結(jié)果需完全相同，否則應(yīng)查找原因并重新測(cè)試。8DB21/T3794—202312廢物處理對(duì)于廢棄的EB溶液可做如下處理：對(duì)于EB含量大于0.5mg/mL的溶液，將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5mg/mL。加入一倍體積的0.5mol/LKMnO4，混勻，再加入等量的2.5mol/L鹽酸，混勻，置室溫?cái)?shù)小時(shí)。加入一倍體積的2.5mol/LNaOH，混勻后按有毒有害廢物處理。對(duì)于EB含量小于0.5mg/mL的溶液，按1mg/mL的量加入活性炭，不時(shí)輕搖混勻，室溫放置1小時(shí)。用濾紙過濾并將活性碳與濾紙密封后按有毒有害廢物處理。13注意事項(xiàng)EB具有毒性，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)劃分清潔區(qū)與EB污染區(qū)。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)帶好手套等防護(hù)措施，若沾染EB后應(yīng)使用大量清水清洗。9(資料性)序列搜索與比對(duì)A.1序列搜索序列搜索在NCBI網(wǎng)站(/)上進(jìn)行，選擇“Resources—DNA&RNA—BLAST(BasicLocalAl入到序列搜索界面。在搜索框中輸入需要搜索的測(cè)序結(jié)果序列，點(diǎn)擊“BLAST”搜索相似序列(圖A.2),以“.fasta”格式下載搜索結(jié)果列表(圖A.3)中相似度最高的序列進(jìn)行比對(duì)。輸入需要搜索的序列圖A.2BLAST搜索序列界面?AboolosphonalatawoucherH112_1cochroneoidasesubuntlone,prldsm?AbousohonisatawouhecHi851ctochcmeox09stont?AbotosphoniktavoucherH_1141cyochromacu?Aboosphonisbtawoutherh11122cbcromeosesturilgeAboglossichoria.120312039Aboglssichonia.1192119293%Aboglschonia.1153115383%Aboglossphoria.115311539Abooossenria.1147114793%Abogbssetoria.114211429Aboglosschonia.114211429Aboglbssghonia.1090108085%0098.18%6600098.18%6800097.88%660口ABoolossphonisatlataKoreewouchecH_110.5cwchrneAbdbssphonisatfataKoreawoucterH_113.4cshronauidasesbunlome.psrisodsmiochordisAboolbsschria107510758%口Aboolossphoniase1MyanmarwoucherHs582crtochomeoxdasestunitoene.parnalcs.mtochondiaAboobssoria.97097083%0093.19%660?AbofosphoniaspMFD16Gos2gitochcmeaxdsnstunitICongn,patatcdtsmdoctondis?AbooossphonispscllsawacherG22tothiorecasidasestuniuCOnorelasmiocthonrsAbooosehria.85285289%0089.79%874AbossphonispsoalsawouwcherH1crocromeondasesturitLCOnoreperteleds.miotordredAbog?BatracobdelapaludosawoucherSOKN016gytochromecoxcLnMN393284.1MN393277.1MN295414.1回Feedback MN393256.1回Feedback選擇“AlignbyClustalW”進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果(圖A.4)另存為“.meg”格式進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)(資料性)B.1進(jìn)化樹的構(gòu)建選用“Bootstrapmethod”,自展值至少為1000次，模型選擇“Kimura2-parametermodel”(圖B.1),點(diǎn)擊“OK”開始構(gòu)建進(jìn)化樹。構(gòu)建的進(jìn)化樹如種類過多矩形樹無法全部顯示，可選用圓形樹展示(圖MX:AnalysisPreferencOptionStatisticalMethod→NeighborjoSubstitutionsType→GeneticCodeTable→NotApplicModel/Method→Kimura2-parametermdTransitions+TransGammaParameter→NotApplicPattemamongLineages→Same(HomGaps/MissingDataTreatment→SiteCoverageCutoff(9%)→NotApplNumberofThreads→7圖B.1使用K2P模型構(gòu)建NJ進(jìn)化樹的設(shè)置界面點(diǎn)擊“ComputePairwiseDistances”,同樣選用“Bootstrapmethod”,自展值至少為1000次，56<DB21/T3794—2023參考文獻(xiàn)[1]HJ710.8-2014,生物多樣性觀測(cè)技術(shù)導(dǎo)則淡水底棲大型無脊椎動(dòng)物[S].[2