動(dòng)物源性飼料中豬源性成分的定性PCR檢測(cè)方法編制說明

編制說明一、任務(wù)來源根據(jù)國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)制(修)訂計(jì)劃安排，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《燕窩的分子生物學(xué)真?zhèn)舞b別方法》（計(jì)劃編號(hào)為2007B149），歸口國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)，由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院負(fù)責(zé)起草工作。二、編制本標(biāo)準(zhǔn)的目的和意義燕窩是由雨燕科金絲燕及同屬類的唾液凝結(jié)而成的物質(zhì)，是一種名貴的保健食品。由于燕窩的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,消費(fèi)者對(duì)其需求日益增長(zhǎng)。而燕窩是一種稀缺資源，世界貿(mào)易統(tǒng)計(jì)每年收獲的燕窩總重量只有大約2000噸。正是在這種供需矛盾和巨大經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，燕窩市場(chǎng)的摻假摻雜現(xiàn)象十分普遍,造假材料主要包括銀耳、豬皮、瓊脂、果膠、蛋清等，使消費(fèi)者蒙受損失。目前缺乏燕窩質(zhì)量相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，十分有必要開展燕窩產(chǎn)品真?zhèn)舞b別方法研究并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以保證燕窩市場(chǎng)的規(guī)范化運(yùn)行〔1，2〕。三、編制原則本標(biāo)準(zhǔn)的編寫是按照GB/T1.1-2000《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》的要求進(jìn)行的。本標(biāo)準(zhǔn)是在“十一五支撐項(xiàng)目”《功能性食品有效成分檢測(cè)和鑒偽技術(shù)的研究》的基礎(chǔ)上制定的。期間參考了大量國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，通過多次實(shí)驗(yàn)和反復(fù)論證，吸收借鑒國(guó)內(nèi)外相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，在遵循標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)性、實(shí)用性和可操作性的原則基礎(chǔ)上，確定了燕窩產(chǎn)品真?zhèn)舞b定的實(shí)時(shí)熒光PCR和雙向電泳檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。四、國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)調(diào)研情況目前燕窩的鑒定方法很多，如表面特征、溶漲性、泡沫、染色、灼燒等簡(jiǎn)單的物理方法，微觀形態(tài)的顯微觀察方法，蛋白質(zhì)含量、紫外吸收、氨基酸組成、唾液酸含量、多糖組分等儀器分析方法。但上述方法存在一些缺陷，例如燕窩是唾液腺的分泌物,不存在明顯的組織細(xì)胞特征,因此顯微鑒別的結(jié)果可靠性不高；燕窩理化鑒別的物質(zhì)基礎(chǔ)在于其粘蛋白,雖有一定的特異性,但由于偽品在制造過程中往往加入一定量的蛋清做粘合劑,故理化鑒別專屬性不強(qiáng)；紅外光譜法存在樣品取樣均勻性問題；氣相色譜法是以寡糖鏈成分為分析基礎(chǔ),形成燕窩的單糖指紋圖譜以作鑒別，但在生物合成過程,糖蛋白中的糖鏈?zhǔn)峭ㄟ^糖基轉(zhuǎn)移酶從核苷酸糖將單糖順次地裝配到已形成的糖鏈?zhǔn)荏w上,最終生成的糖鏈結(jié)構(gòu)不但決定于每個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的專一性,而且也受到肽鏈結(jié)構(gòu)和形成異頭鍵能力的影響,故糖鏈的合成過程不是模板化的,可以終止不同階段,因而糖鏈結(jié)構(gòu)普遍存在微不均一性。這種微不均一性會(huì)影響鑒別結(jié)果的可靠性〔1，2，3，4〕。相比于上述方法，電泳鑒定是以燕窩所含水溶性蛋白質(zhì)為分析基礎(chǔ),已經(jīng)證明燕窩的蛋白質(zhì)是燕窩藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。因此,理論上電泳中蛋白質(zhì)譜帶的位置、顯色的深淺可很好地反映燕窩的真?zhèn)魏唾|(zhì)量,但由于燕窩蛋白富含唾液酸,影響其電泳分離效果。本方法采用的雙向電泳法，結(jié)合了等點(diǎn)聚焦和SDS垂直電泳技術(shù)，明顯增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分離效果。另外，實(shí)時(shí)熒光PCR法已被廣泛應(yīng)用與物種鑒定，可用于燕窩制品中燕窩成分的快速檢測(cè)。五、主要技術(shù)內(nèi)容（一）材料與方法1、樣品種類及來源4份燕窩樣品（蘇普官燕、云南白燕、瓜目官燕、瓜曼官燕）由浙江杭州胡慶余堂保健品有限公司提供，另有5份燕窩樣品（白燕盞）由廣東檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心提供。蔥、大豆、胡蘿卜、黃瓜、雞、鹿、米、木瓜、牛、芹菜、土豆、兔、西瓜、鱈魚、鴨、羊、玉米、豬、銀耳等19份樣品購(gòu)自市場(chǎng)。2、主要試劑丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、7cm預(yù)制pH4.7-5.9梯度膠條、100×兩性電解質(zhì)（pH4.7-5.9，pH6.3-8.3）、蛋白質(zhì)純化試劑盒、水化上樣緩沖液、膠條平衡緩沖液I、膠條平衡緩沖液II、低溶點(diǎn)瓊脂糖、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、礦物油、DTT、碘乙酰胺、考馬斯亮藍(lán)G250、過硫酸銨等購(gòu)自美國(guó)伯樂生物公司；Nucleospin?食品DNA純化試劑盒購(gòu)自香港基因公司；SYBRgreenMasterMix試劑盒購(gòu)自北京歐比特公司。3、主要儀器設(shè)備等電聚焦儀、恒溫水浴鍋、冷凍離心機(jī)、微量移液器、垂直板電泳儀、超聲波破碎儀、天平、凝膠成像儀、真空濃縮儀、、冷凍干燥儀、熒光PCR儀。4、DNA提取將樣品粉碎，稱取40mg樣品粉末，按照試劑盒說明書提取核酸DNA提取和純化，產(chǎn)物溶于50μL水。5、實(shí)時(shí)熒光PCR采用SYBRgreenMasterMix試劑盒，按照25μL體系配制反應(yīng)液，其中模板體積5μL。引物及反應(yīng)參數(shù)如表1，2所示。表1檢測(cè)用引物名稱序列目的基因Cfib5’端引物Cfib3’端引物5’-TGAATTGAGCCTGTCGTCTG-3’5’-TGCTCCATAGCCAAACAAGA-3’纖維蛋白原基因NA5’端引物NA3’端引物5’-ATTCGAAAAATCCTGGCCTT-3’5’-CATTGGGGTTTTTGTTCAGG-3’NADH脫氫酶表2實(shí)時(shí)熒光定性PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)作用時(shí)間/s溫度/℃去污染12050活化DNA合成酶和預(yù)變性60095PCR（40個(gè)循環(huán)）變性1595延伸6060變性反應(yīng)（1個(gè)循環(huán)）變性1595復(fù)性2060變性1595最后兩個(gè)步驟之間升溫時(shí)間設(shè)為最大值6、蛋白質(zhì)提取將樣品充分研磨，稱取500mg于50ml離心管中，加10ml水，4℃放置24h，1000×g離心10分鐘，吸取800μL上清于1.5ml離心管中，共6管。真空離心濃縮3h，液體縮減至約200μL。使用蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白除鹽，冷凍干燥后用300μL上樣緩沖液溶解，具體操作是通過超聲破碎輔助，用上樣緩沖液依次溶解所有6管蛋白。12000×g離心5分鐘，取上清進(jìn)行等點(diǎn)聚焦。每個(gè)樣品制備兩份蛋白上清，同時(shí)進(jìn)行等電聚焦和SDS。7、等電聚焦將IGP膠條于室溫放置10分鐘，沿著聚焦盤中槽的邊緣從左至右線性加入蛋白樣品。在槽兩端1cm左右不要加樣，中間樣品液保持連貫，去除氣泡。用鑷子去除IPG膠條保護(hù)層，輕輕將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤樣品溶液上，使膠條正極對(duì)應(yīng)于聚焦盤正極。去除氣泡。在膠條上覆蓋3ml礦物油。蓋上蓋子，設(shè)置等點(diǎn)聚焦程序：水化50V12h，線性250V30min，快速500V30min,線性4000V3h,快速4000V至20000Vh,快速500V任意時(shí)間。聚焦結(jié)束后，立即進(jìn)行平衡和第二向SDS電泳，否則將膠條置于水化盤中-20℃保存。8、垂直電泳配制10％聚丙烯酰胺凝膠（7cm×7cm）。將聚焦好的IPG膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上，另將一份濾紙用水浸濕，直接置于膠條上，吸干膠條上礦物油和多余樣品。將膠條放置于水化盤中，加入2ml平衡緩沖液I，緩慢搖15min，取出膠條，豎立在濾紙上去除多余液體，將膠條放置于水化盤中干凈的槽中，加入平衡緩沖液II，搖15min,同法吸取膠條上多余液體，將膠條膠面朝上放在聚丙烯酰胺凝膠的長(zhǎng)玻璃板上，用少量熱的低溶點(diǎn)瓊脂糖封膠液滴在玻璃板上，同時(shí)使用鑷子，輕輕將膠條推入凝膠膠面，不要在膠條下放產(chǎn)生氣泡。同時(shí)在分子量孔中加蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品。用封膠液封閉膠條。凝固后，將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。加電泳緩沖液，進(jìn)行電泳，電壓設(shè)置為50V30min，100V3h，至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)底部。9、染色與成像電泳結(jié)束后，輕輕撬開玻璃，取出凝膠，用固定液固定2h，再用染色液染色3h，用脫色液脫色至背景干凈。用凝膠成像儀成像。使用雙向電泳圖像分析軟件將圖譜轉(zhuǎn)換成高斯圖譜。（二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.實(shí)時(shí)熒光PCR法特異性M1M1234567圖1.不同提取法DNA的Cfib擴(kuò)增結(jié)果MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（從上至下為600，500，400，300，200，100bp）1，2.CTAB法；3，4PromegaWizard試劑盒法；5，6Nucleospin試劑盒法；7.空白對(duì)照。針對(duì)燕窩纖維蛋白原基因和NADH脫氫酶基因分別設(shè)計(jì)引物，通過篩選得到Cfib和NA體系。如圖2，3所示，兩個(gè)引物均顯示良好特異性，而且雙引物的應(yīng)用有助于提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。由于燕窩產(chǎn)地不同，品種不同，因此需要對(duì)不同產(chǎn)地來源燕窩樣品檢查引物的涵蓋范圍。如圖4，5所示，兩個(gè)引物對(duì)9個(gè)燕窩樣品均得到Tm值一致的信號(hào)峰。圖2NADH脫氫酶引物NA體系溶解曲線特異性箭頭指示燕窩DNA，其余信號(hào)峰來自蔥、大豆、胡蘿卜、黃瓜、雞、鹿、米、木瓜、牛、芹菜、土豆、兔、西瓜、鱈魚、鴨、羊、玉米、豬、銀耳等19種樣品。圖3纖維蛋白原基因引物Cfib體系溶解曲線特異性箭頭指示燕窩DNA，其余信號(hào)峰來自蔥、大豆、胡蘿卜、黃瓜、雞、鹿、米、木瓜、牛、芹菜、土豆、兔、西瓜、鱈魚、鴨、羊、玉米、豬、銀耳等18種樣品。圖49個(gè)不同產(chǎn)地燕窩樣品的NA體系溶解曲線圖59個(gè)不同產(chǎn)地燕窩樣品的Cfib體系溶解曲線實(shí)時(shí)熒光PCR法靈敏度圖6是Cfib體系的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可檢測(cè)到0.5％的燕窩/銀耳混合物。NA體系具有相同的靈敏度。圖6Cfib體系的靈敏度箭頭指示0.5％燕窩/銀耳混合物3.燕窩雙向電泳圖譜特征圖7是9份燕窩標(biāo)準(zhǔn)樣品的雙向電泳圖譜。圖8是最常見的摻假物銀耳和燕窩混合物的雙向電泳圖譜。燕窩圖譜的特征包括1)蛋白點(diǎn)為集中分布在圖譜中央位置的2-4行平行的蛋白點(diǎn)群（橢圓形和方形標(biāo)識(shí)的模式）；2)蛋白點(diǎn)分子量集中在41KD-28KD；3)蛋白點(diǎn)等電點(diǎn)基本位于4.7-5.9中間以及偏酸位置。銀耳燕窩混合物圖譜顯示含50％銀耳的樣品能明顯檢測(cè)到摻假物蛋白（虛線標(biāo)識(shí)），20％的樣品圖譜中摻假物蛋白較弱，但尚能識(shí)別。因此，本法對(duì)銀耳的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到20％。另外，應(yīng)當(dāng)看出，不同產(chǎn)地和不同等級(jí)燕窩的圖譜有一些差異，主要表現(xiàn)為蛋白點(diǎn)的深淺，數(shù)量，等電點(diǎn)方面，反映了不同品種金絲燕的生物屬性的差異以及環(huán)境和制備方法導(dǎo)致的燕窩品質(zhì)的差別，但由于不同燕窩樣品的圖譜都具有明顯的共同特征，因此局部的差別不僅不會(huì)對(duì)真假燕窩的判斷帶來影響，而且為不同產(chǎn)地和不同等級(jí)燕窩之間的鑒別提供了豐富的信息。圖7燕窩標(biāo)準(zhǔn)樣品雙向電泳圖譜M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)從上至下為：194KD、104KD、57KD、41KD、28KD、21KD、16KD。5.9PI4.75.9PI4.75.9PI4.75.9PI4.7圖8銀耳與蘇普官燕混合物的電泳圖譜M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)從上至下為：194KD、104KD、57KD、41KD、28KD、21KD、16KD。實(shí)線為燕窩蛋白，虛線為銀耳蛋白。4、雙向電泳方法的重現(xiàn)性雙向電泳圖譜的重現(xiàn)性對(duì)本方法的實(shí)用性至關(guān)重要。我們對(duì)一個(gè)燕窩標(biāo)準(zhǔn)樣品分別進(jìn)行了三次蛋白質(zhì)提取和雙向電泳實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖9所示，A,B,C三個(gè)圖譜的樣品量依次為50mg,80mg,100mg。三個(gè)圖譜重現(xiàn)性良好，蛋白點(diǎn)著色強(qiáng)度隨樣品量增加而增加。圖9燕窩標(biāo)準(zhǔn)樣品雙向電泳圖譜重現(xiàn)性A.50mg樣品B.80mg樣品C.100mg樣品M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)從上至下為：194KD、104KD、57KD、41KD、28KD、21KD、16KD。六、結(jié)論本方法采用實(shí)時(shí)熒光PCR法進(jìn)行燕窩成分檢測(cè)，顯示引物特異性、涵蓋范圍、靈敏度均滿足要求，可作為燕窩制品中燕窩成分快速篩查方法；采用雙向電泳法對(duì)燕窩制品進(jìn)行真?zhèn)舞b別，結(jié)果顯示燕窩雙向電泳圖譜特征明顯，與摻假物圖譜差異顯