第七章-發(fā)酵染菌及防治

《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治第七章

發(fā)酵染菌及防治《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治純種發(fā)酵（單菌或混菌）；菌種以外的微生物都被視為雜菌。所謂染菌，是指在發(fā)酵培養(yǎng)基中侵入了有礙生產(chǎn)的其它微生物。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)都有可能遭遇雜菌或噬菌體的污染。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或質(zhì)量，重者可能導致倒罐，甚至停產(chǎn)，造成原料、人力和設備動力的浪費。

防止雜菌和噬菌體污染是保證發(fā)酵正常進行的關(guān)鍵之一染菌的影響造成大量原材料的浪費，在經(jīng)濟上造成巨大損失擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計劃。遇到連續(xù)染菌，特別在找不到染菌原因往往會影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性。影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治一、雜菌污染的原因與防治

1、從染菌的現(xiàn)象分析染菌的原因

1）從染菌的時間分析●早期（如接種后12h或24h），除了種子帶菌外，主要是培養(yǎng)基或設備滅菌不徹底?！裣喾?，中、后期染菌則可能與中間補料、設備滲漏以及操作不合理等有關(guān)，也可能是空氣過濾器不嚴所致。2）從污染的雜菌類型分析●污染耐熱的芽孢桿菌，多數(shù)是因培養(yǎng)基滅菌不徹底或設備存在死角所致；●污染無芽孢桿菌、球菌等不耐熱菌，可能是從蒸汽的冷凝水中帶來的，或空氣系統(tǒng)不嚴造成。3）從發(fā)酵罐及批次分析大批發(fā)酵罐染菌是指整個工廠各個產(chǎn)品的發(fā)酵罐都出現(xiàn)雜菌現(xiàn)象，而且染的是同一種菌，主要是空氣過濾器除菌不凈，空氣帶菌而造成的。個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌，較多地是由于設備問題而造成的。如閥門的滲漏或罐體破損，特別是蛇形管的穿孔，有時不易察覺。有時設備破損引起的染菌會出現(xiàn)每批染菌時間前移現(xiàn)象。個別發(fā)酵罐偶然染菌的原因最為復雜，各種染菌途徑都有可能引起?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治根據(jù)谷氨酸發(fā)酵情況分析，染菌原因以設備問題（設備滲漏、管道不嚴、設備死角）和空氣問題（過濾器不嚴、過濾器失效、過濾器受潮）為主，種子（二級種子染菌）次之，而培養(yǎng)基消毒不透的情況較少。

發(fā)酵染菌對不同品種的影響放線菌由于生長的最適pH為7左右，因此染細菌為多，而霉菌生長pH為5左右，因此染酵母菌為多。

青霉素發(fā)酵染菌，絕大多數(shù)雜菌都能直接產(chǎn)生青霉素酶，而另一些雜菌則可被青霉素誘導而產(chǎn)生青霉素酶。不論在發(fā)酵前期、中期或后期，染有能產(chǎn)生青霉素酶的雜菌，都能使青霉素迅速破壞。《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治

鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會造成不同程度的危害。如雜菌大量消耗營養(yǎng)干擾生產(chǎn)菌的正常代謝；改變pH，降低產(chǎn)量。

灰黃霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，對細菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。疫苗生產(chǎn)危害很大?，F(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應全部廢棄。因此，發(fā)酵罐容積越大，污染雜菌后的損失也越大?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治2、防止染菌要點（1）空氣系統(tǒng)

提高空壓機進口空氣的潔凈度、防止空氣帶油、水及過濾器失效。

如提高空壓機吸氣口位置并加強壓縮前的過濾；防止空氣冷卻器漏水而進入空氣系統(tǒng)；在空氣過濾器滅菌時要防止沖翻介質(zhì)而短路，防止烤焦介質(zhì)或著火；裝填纖維介質(zhì)時要壓緊；操作中要防止空氣的壓力劇變和流速激增等。

《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治（2）設備發(fā)酵罐及其附屬設備應注意嚴密和防止泄漏，避免形成“死角”。與物料、空氣、下水道連接的閥門皆需保證嚴密度。用超凈工作臺及凈化室代替無菌室，以提高無菌程度。連消設備的連消塔要簡單，易拆裝清理，操作時蒸汽能與物料均勻混合，并易控溫度；維持罐在料液輸送時培養(yǎng)基在罐中能均勻地緩慢上升，不走短路。《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治（3）工藝操作①空罐準備

放罐后應進行全面檢查和清洗。要清理罐內(nèi)殘渣，去除罐壁污垢，清除空氣分布管、溫度計套管等處堆積的污垢及罐內(nèi)的“死角”。要防止端面軸封漏氣、攪拌添料箱及閥門滲漏等。蛇管和夾層要按設計規(guī)定的壓力定期試壓?？障麜r應先將罐內(nèi)空氣排盡，保持蒸汽暢通，閥門、管道均要徹底滅菌?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治②實罐滅菌配制培養(yǎng)基時要防止原料結(jié)塊。配料罐出口應有篩板過濾器（篩孔直徑≤0.5mm），以防塊狀物及異物進入罐內(nèi)。滅菌時，要保證各路進氣暢通及罐內(nèi)料液翻騰激烈，控制好溫度與壓力，嚴防泡沫冒頂及料液倒流到空氣系統(tǒng)中。③連消料液進入連消塔前需先預熱。滅菌過程中，料液溫度及其在維持罐停留的時間都必須符合要求，確保滅菌徹底。當冷卻管開放冷水時，防止因突然冷卻造成負壓而吸入外界空氣。為確保滅菌溫度穩(wěn)定，連消必須實現(xiàn)自動控制。④補料補入發(fā)酵罐內(nèi)的料液一定要保證無菌?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治⑥無菌試驗無菌試驗要嚴格取樣操作，力求減少誤差。應同時用肉湯和雙碟作對照，以便迅速作出判斷。當發(fā)現(xiàn)染菌時，要通過分辨菌型來探索菌源，并對雜菌做耐熱試驗考察。如果懷疑種子罐染菌，則種子不能輕率進發(fā)酵罐?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治⑤種子

有關(guān)種子操作的制度要嚴格遵守；搖瓶瓶塞要確保嚴密。3、無菌檢查與染菌的處理

為了防止在種子培養(yǎng)或發(fā)酵過程中污染雜菌，在接種前后、種子培養(yǎng)及發(fā)酵過程中分別進行無菌檢查，以便及時發(fā)現(xiàn)染菌，并在染菌后及時進行必要處理是很重要的。

（1）無菌檢查

◆

染菌通常通過3個途徑發(fā)現(xiàn)：無菌試驗、發(fā)酵液直接鏡檢、發(fā)酵液的生化分析。其中無菌試驗是判斷染菌的主要依據(jù)。

◆

無菌試驗方法有雙碟培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、肉湯培養(yǎng)等，其中以雙碟和肉湯培養(yǎng)為主?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治細菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯：glucose10g,peptone5g,beefextract5g,NaCl5g,distilledwater1000ml,pH7.2~7.4。酚紅肉湯：營養(yǎng)肉湯+1%phenolred3ml。營養(yǎng)瓊脂：glucose5g,peptone10g,beefextract3g,NaCl5g,agar15-20g,distilledwater1000ml,pH7.2~7.4?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治酵母培養(yǎng)基

薩氏培養(yǎng)基（Sabouraud’sagar）：glucose40g,peptone10g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH5.6。霉菌培養(yǎng)基

察氏培養(yǎng)基（Czapek’sagar）：sucrose30g,NaNO33g,K2HPO41g,MgSO4

7H2O0.5g,KCl0.5g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH6.6?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治（2）染菌的判斷以肉湯和雙碟培養(yǎng)的反應為主，鏡檢為輔。每8h一次的無菌檢查，至少用2只酚紅肉湯及1只雙碟同時取樣。無菌試驗時，如果肉湯連續(xù)3次變色（紅→黃）或產(chǎn)生渾濁，或雙碟培養(yǎng)連續(xù)3次有雜菌菌落，即判斷為染菌。

《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治（3）染菌率的統(tǒng)計

以發(fā)酵罐染菌批（次）為基準，染菌罐批（次）應包括染菌重消的重復染菌批（次）在內(nèi)。整個發(fā)酵周期中，無論前期或后期染菌，均作“染菌”論處。發(fā)酵（罐）染菌批（次）總投罐批（次）染菌率（%）=

100%

《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所多年來抗生素發(fā)酵染菌原因分析項目百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌9.64接種時罐壓跌零0.19培養(yǎng)基滅菌不透0.79總空氣系統(tǒng)有菌19.96泡沫冒頂0.48夾套穿孔12.36盤管穿孔5.89接種管穿孔0.39閥門滲漏1.45攪拌軸密封滲漏2.09罐蓋漏1.54其它設備滲漏10.13操作原因10.15

原因不明24.94《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治上海第三制藥廠染菌原因分析項目百分率%種子帶菌14.15盤管穿孔14.20閥門滲漏23.30空氣系統(tǒng)有菌10.0管理不善25.80其它7.49原因不明5.78《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治管理不善而染菌的有31個罐批，占25.08％經(jīng)分析有下表所列原因：項目百分率%進罐前未做設備嚴密度檢查25.8接種違反操作規(guī)程25.8檢修質(zhì)量缺乏驗收制度19.35操作不熟練19.35配料違反工藝規(guī)程6.45調(diào)度不當3.25《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治（4）染菌的處理

發(fā)現(xiàn)染菌后，應立即根據(jù)染菌的種類及產(chǎn)生菌的菌齡等具體情況分別進行處理。除據(jù)染菌時間及危害程度對污染罐進行挽救或處理外，對有關(guān)設備也應進行處理。發(fā)酵中后期染菌或前期染菌輕微而發(fā)現(xiàn)較晚時，可加入適當?shù)臍⒕鷦┗蚩股兀换虬迅邌挝坏暮笃诎l(fā)酵液壓一部分到染菌罐中，抑制雜菌生長速度；或者降低罐溫，減緩雜菌繁殖速度。種子罐染菌后，種子不能再接入發(fā)酵罐中，這時可用備用種子接種。如無備用種子，則可選一適當培養(yǎng)齡的發(fā)酵罐培養(yǎng)物作種子，即生產(chǎn)上所說的“倒種”。發(fā)酵罐前期染菌后，如培養(yǎng)基中C、N含量尚高，則可重新滅菌，接種后再運轉(zhuǎn)；若染的雜菌危害性較大，則放掉部分料液，補入新料液，重新滅菌、接種。《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。原因發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。在這個時期要特別警惕以制止染菌的發(fā)生。染菌措施可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補加一些營養(yǎng)，重新接種再用。《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治發(fā)酵中期染菌發(fā)酵中期染菌會嚴重干擾產(chǎn)生菌的代謝。雜菌大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停止，有時甚至會使已產(chǎn)生的產(chǎn)物分解。有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫。措施降溫培養(yǎng)，減少補料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治發(fā)酵后期染菌發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴重，又破壞性較大，可以提前放罐。《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治二、噬菌體污染的防治

在國內(nèi)外，發(fā)酵工業(yè)中噬菌體的危害是一個普遍的問題。對于丙酮丁醇、氨基酸、酶制劑和抗生素等發(fā)酵都有噬菌體的危害，所帶來的經(jīng)濟損失是相當驚人的?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治1、噬菌體的污染源噬菌體廣泛地存在于適合宿主生存的泥土、污水和空氣中；發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌的噬菌體可以從異常發(fā)酵液和工廠環(huán)境中分離出來，溶源性細菌也混雜在工廠周圍環(huán)境的細菌中；一個新的發(fā)酵工廠往往在投產(chǎn)不久便會出現(xiàn)噬菌體污染；研究認為，當有許多細菌存在時，相應的噬菌體就會馬上出現(xiàn)，其濃度在自然條件下很容易增高?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治工廠本身的排放物有時也給重復污染提供了噬菌體來源。生產(chǎn)過程中發(fā)酵氣體排出，可以帶有大量的生產(chǎn)菌。在生產(chǎn)罐污染有少量噬菌體（尚可進行生產(chǎn)）時，噬菌體也被排到環(huán)境中，造成惡性循環(huán)。廢棄的發(fā)酵液處理不當可以成為難以對付的污染源?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治2、噬菌體污染與發(fā)酵異常

噬菌體污染后的情況因發(fā)酵工業(yè)的種類、污染的噬菌體特性、污染時間、感染復度（即培養(yǎng)物內(nèi)的噬菌體與細菌的比率）、培養(yǎng)基成分、發(fā)酵罐內(nèi)的物理和化學條件不同而異。即使同樣的噬菌體并不一定引起同樣的異常發(fā)酵情況。《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治一般來說，噬菌體污染引起的異常發(fā)酵有以下表現(xiàn)：（1）污染較輕，或在發(fā)酵末期污染，則使發(fā)酵過程減慢或降低發(fā)酵產(chǎn)率。也有的行業(yè)在這種情況下產(chǎn)率反而增高；（2）在細菌對數(shù)生長期污染，而且污染量大，就會造成細菌溶解，發(fā)酵終止。噬菌體污染后可以觀察到糖消耗減慢，pH異常變化，產(chǎn)氣減少，發(fā)酵稀薄，繼之活的生產(chǎn)菌減少。通過測定可過濾性、傳染性、宿主特異性、溶菌斑形成能力和電鏡觀察來鑒別異常發(fā)酵中的噬菌體。

《發(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治3、噬菌體污染的防治

發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中噬菌體污染是一個復雜的問題，雖然至今還沒有完全滿意地解決這一問題，但采取一些措施來防治噬菌體的污染，也有一定的成效。

（1）防止噬菌體入侵和蔓延

發(fā)酵工廠生產(chǎn)菌的噬菌體廣泛存在于其周圍環(huán)境中，為了防止噬菌體的污染，保持周圍環(huán)境的清潔是必要的，所有設備和設施如發(fā)酵罐、管道系統(tǒng)等要進行滅菌處理。妥善地保藏菌種、對原料和水進行無菌處理、對工廠空氣、種子、發(fā)酵液、泥土和污水的噬菌體濃度進行日常檢查，即使空氣中噬菌體濃度極低時，也要進行檢測?！栋l(fā)酵工程》第七章發(fā)酵染菌及防治

噴灑氯化物或殺藻胺(benzalkoniumchlori