洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架的觀察

洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架的觀察

洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架的觀察一、實驗?zāi)康?/p>

1、掌握植物細(xì)胞骨架顯示的原理及染色方法.2、觀察光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)二、實驗原理

細(xì)胞骨架（cytoskeleton）是指真核細(xì)胞中的纖維蛋白所組成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。①、細(xì)胞骨架的概念紅：微絲綠：微管微管主要成分微管蛋白微管主要分布在核周圍，呈放射狀向四周擴(kuò)散電鏡下的微管1.微管蛋白（一）微管的化學(xué)組成微管蛋白

微管蛋白

微管蛋白異二聚體2個鳥嘌呤核苷酸（GTP)結(jié)合位點?？膳c秋水仙素、長春花堿結(jié)合。

微管蛋白

微管蛋白異二聚體聚合首位相連原纖維微管（13）微絲的形態(tài)與組分形態(tài)：是一類由蛋白纖維組成的實心纖維細(xì)絲。直徑5-7nm，長短不一。在細(xì)胞中，微絲可成束、成網(wǎng)或纖維狀分散分布，主要分布與細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)。在具有運動功能的細(xì)胞中比較發(fā)達(dá)。

微絲化學(xué)成分肌動蛋白肌動蛋白結(jié)合蛋白

中間絲

直徑介與微管與微絲之間，故得名中間絲（中間纖維IF）

8——10nm。中間纖維則分布在整個細(xì)胞中。

IF結(jié)構(gòu)穩(wěn)定：既不受秋水仙素也不受細(xì)胞松弛B素影響，并且也沒有極性。二、實驗原理細(xì)胞骨架細(xì)胞生長、運動維持細(xì)胞形態(tài)分裂、分化基因表達(dá)能量轉(zhuǎn)換信息傳遞物質(zhì)運輸②細(xì)胞骨架的功能微管微絲中間絲

二、實驗原理

③細(xì)胞骨架組成及分類

根據(jù)組成成分及形態(tài)結(jié)構(gòu)細(xì)胞質(zhì)骨架細(xì)胞骨架細(xì)胞膜骨架細(xì)胞核骨架細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞質(zhì)骨架廣義狹義二、實驗原理

④細(xì)胞骨架觀察方法電鏡組織化學(xué)間接免疫熒光酶標(biāo)觀察方法二、實驗原理

⑤試劑選用原因1TritonX-100可溶解抽提細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，但不破壞細(xì)胞骨架系統(tǒng)，因此顯得更清晰3M-緩沖液洗滌細(xì)胞，可以提高骨架穩(wěn)定性2戊二醛固定能較好保存骨架成分、考馬斯亮藍(lán)R250染色，使骨架蛋白著色，胞質(zhì)背景著色弱，有利于骨架顯示

注意微絲微管和中間絲都是直徑很小的結(jié)構(gòu)，最大的單根微管才25nm左右，只能在電鏡下觀察。本實驗用普通光鏡是因為骨架纖維成束分布，染色后有夸大作用。由于細(xì)胞經(jīng)抽提后剩下的主要是細(xì)胞骨架，使之顯現(xiàn)更清晰。M緩沖液M緩沖液使細(xì)胞骨架中的微絲保持穩(wěn)定。在M緩沖液中，其中咪唑是緩沖劑EGTA和EDTA螯合Ca離子，溶液并提供Mg離子，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張，便于觀察。TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚)是一種非離子型表面活性劑（或稱去污劑）。分子量為646.86（C34H62O11）。它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對細(xì)胞膜的通透性。非離子型表面活性劑它在水溶液中不產(chǎn)生離子的一種表面活性劑。它在水中的溶解是由于它具有對水親和力很強的官能團(tuán)。表面活性劑表面活性劑分子結(jié)構(gòu)具有兩親性：一端為親水基團(tuán)，另一端為疏水基團(tuán)。溶解于水中以后，表面活性劑能降低水的表面張力，并提高有機(jī)化合物的可溶性?？捡R斯亮藍(lán)G-250考馬斯亮藍(lán)有G-250和R-250兩種。其中考馬斯亮藍(lán)G-250由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速，常用來作為蛋白質(zhì)含量的測定。3%-戊二醛作為一種有機(jī)交聯(lián)劑戊二醛在一定條件下能將單體、線型高分子或預(yù)聚物轉(zhuǎn)變成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。戊二醛在1%濃度時，交聯(lián)度已達(dá)到很高的程度，在此濃度以下，隨濃度下降，交聯(lián)度下降，溶脹度和降解率增加。濃度超過1%時，各指標(biāo)無明顯變化。交聯(lián)劑是一種能在線型分子間起架橋作用，從而使多個線型分子相互鍵合交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。促進(jìn)或調(diào)節(jié)聚合物分子鏈間共價鍵或離子鍵形成的物質(zhì)。三、實驗用品1、材料2、器材3、試劑洋蔥鱗莖顯微鏡、小燒杯、滴管、載玻片、蓋玻片、鑷子⑴M-緩沖液⑵6mmol/L磷酸緩沖液⑶1%TritonX-100⑷0.2%考馬斯亮藍(lán)R250⑸3%戊二醛②3.0%戊二醛：用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制

③0.2％考馬斯亮藍(lán)R250：甲醇46.5ml，冰乙酸7ml，蒸餾水46.5ml三、實驗用品

4、試劑配制①1%TritonX-100：一般配成30%儲備液，通常TritonX-100與M-緩沖液以所需比例混合置于30-40℃水浴2-3小時，以便液體充分混勻。使用時將30%儲備液臨時稀釋成1%。

③M-緩沖液四、實驗方法1、撕取2、抽提3、沖洗4、固定吸去緩沖液，用1%TritonX-100處理洋蔥表皮25min。3％戊二醛固定30min撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞約1cm2大小若干片，置于磷酸緩沖液的培養(yǎng)皿中，使其下沉，（1~2min)吸去TritonX—l00，用M一緩沖液洗3次，每次5分鐘四、實驗方法5、沖洗6、染色7、制片8、觀察PH6.8磷酸