呼吸道標(biāo)本采集和結(jié)果解讀

破解呼吸道感染病原學(xué)診斷的困境：需要你我他Email：whuibj@163.comL.CN.MKT.GM.04.2016.50592021/6/271內(nèi)容

呼吸道感染病原學(xué)

困境和挑戰(zhàn)可能的破解之道22021/6/272TheThreeMostImportantElementsinPracticingMedicineWilliamOsler,ThePrinciplesandPracticeofMedicine,1892Diagnosis!Diagnosis!Diagnosis!

Medicineisascienceofuncertaintyandanartofprobability.

最重要的是不要看遠(yuǎn)方模糊的事，而是做好手頭清楚的事

2021/6/273歐洲流調(diào)：CAP的主要病原體病原體檢出率(%)一項(xiàng)1996年11月至2008年7月在西班牙進(jìn)行的CAP流調(diào)研究，納入3,524例CAP患者(15%門診患者,85%住院患者)，其中1,463例患者病原學(xué)呈陽性反應(yīng)。CillónizC,etal.Thorax.2011;66(4):340-346.肺炎鏈球菌和非典型病原體是CAP最主要致病菌，混合感染占重要地位N=14632021/6/274

我國CAP的主要致病菌病原體檢出率(%)入選2003年12月至2004年11月中國7個(gè)城市12個(gè)中心的665例CAP患者并進(jìn)行病原體檢測2006年我國CAP的大型流調(diào)研究顯示：肺炎支原體是我國CAP的最主要致病菌，其次為肺炎鏈球菌1在我國已經(jīng)完成的另兩項(xiàng)全國多中心成人CAP調(diào)查中，肺炎支原體感染的比例分別達(dá)到了20.7%和38.9%，均已超過了肺炎鏈球菌(分離率分別為10.3%和14.8%)，成為成人CAP最常見的致病原2,3混合感染在社區(qū)呼吸道感染中占有重要地位，以細(xì)菌合并非典型病原體混合感染居多11.劉又寧陳民鈞趙鐵梅等.中華結(jié)核和呼吸雜志.2006;29(1):3-8；LiuYetal.BMCInfectiousDiseases.2009;9:31.3.TaoLLetal.ChinMedJ(Engl).2012;125(17):2967-2972.2021/6/275成人病毒性肺炎發(fā)病率高，但長期被忽視每年新發(fā)病毒性肺炎約200萬例，其中成人和兒童各100萬例10項(xiàng)成年人CAP綜述（共2910例），病毒性肺炎占22%JenningsLC,etal.Thorax2008;

63:42-8.RuuskanenO.Lancet2011;377:1264-75.6病毒科病毒種核酸類型正粘病毒科流感病毒單股RNA副粘病毒科呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、人類偏肺病毒單股RNA披膜病毒科風(fēng)疹病毒單股RNA小RNA病毒科鼻病毒、柯薩奇病毒和?？刹《镜牟糠中蛣e單股RNA腺病毒科腺病毒雙股DNA冠狀病毒科人類冠狀病毒、SARS冠狀病毒單股RNA皰疹病毒科單純皰疹病毒、帶狀皰疹、EB和CMV雙股DNA細(xì)小病毒科人類博卡病毒單鏈DNA呼腸孤病毒科呼腸孤病毒（1，2，3，4型）雙鏈RNA2021/6/276PathogenidentifiedPatientsn(%)RespiratoryViruses262(27.5)

InfluenzavirusA94(9.9)

Humanrhinovirus41(4.3)

Adenovirus40(4.2)

Humanmetapneumovirus17(1.8)

Parainfluenzavirustype116(1.7)

Parainfluenzavirustype314(1.5)

Parainfluenzavirustype211(1.2)

InfluenzavirusB6(0.6)

Humanenterovirus5(0.5)

RespiratorysyncytialvirustypeA5(0.5)

RespiratorysyncytialvirustypeB4(0.4)

CoronavirusOC43/HKU14(0.4)

Coronavirus229E/NL634(0.4)

Parainfluenzavirustype41(0.1)Bocavirus0(0.0)北京市成人CAP監(jiān)測網(wǎng)：病毒性肺炎27.5%2010-2012年本課題組牽頭，聯(lián)合北京市12家醫(yī)院954例成人CAP患者中，病毒性肺炎占27.5%。重要病毒：流感病毒、鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒。

JiuXinQu.BMCInfectDIs2015onlinefirst72021/6/277上呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥82021/6/278上呼吸道感染標(biāo)本的采集9

用拭子同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁（3-5次）

咽拭子的采集方法2021/6/279咽拭子的采集正確拿咽拭子的方法錯(cuò)誤拿咽拭子的方法上呼吸道感染標(biāo)本的采集2021/6/2710上呼吸道感染標(biāo)本的采集11

請患者頭部保持不動(dòng)，將拭子輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)緩緩插入患者鼻腔，不要用力，

當(dāng)遇到阻力后即到達(dá)后鼻咽，停留數(shù)秒吸取分泌物，輕輕旋轉(zhuǎn)取出拭子鼻拭子標(biāo)本的采集2021/6/2711病毒：選用滌綸或人造棉頭塑料柄的拭子（如：聚丙烯纖維頭），不能用藻酸鈣及木柄拭子，可使病毒失活或抑制PCR反應(yīng)。脫脂棉拭子含有熒光物質(zhì)，影響熒光定量PCR結(jié)果細(xì)菌：選用藻酸鈣拭子。棉拭子、尼龍拭子可抑制百日咳博德特菌生長采樣后用于病毒檢測的拭子，將拭子頭浸入含一定量采樣液的螺口管中，尾部棄去，旋緊管蓋，及時(shí)送檢，如不能立即送檢，可暫時(shí)儲(chǔ)存于4℃冰箱內(nèi)，嚴(yán)禁-20℃冷凍。用于細(xì)菌檢測的拭子插回采樣管中或適宜的轉(zhuǎn)運(yùn)裝置中，立即送檢12上呼吸道感染標(biāo)本的采集支原體保存液病毒采樣拭子細(xì)菌采樣拭子2021/6/2712下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥132021/6/2713下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥14下呼吸道標(biāo)本中，痰&支氣管鏡標(biāo)本最為重要！2021/6/2714Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534標(biāo)本的質(zhì)量15標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:53416標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534Inconclusion,sputumGramstainishighlyspecificfortheetiologicdiagnosisofCAPandHCAPandusefulinguidingpathogen-targetedantibiotictreatment17病例1男性，64歲既往史：心肌梗死2次嚴(yán)重的充血性心力衰竭，行雙側(cè)冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)心臟移植（植入式心臟復(fù)律除顫器）癥狀：呼吸困難、干咳、低熱初步診斷：支氣管肺泡灌洗：無致病菌，

正常菌群（真菌和分枝桿菌）胸片：右下肺局限性密度影肺癌？SeifertH.CID,2009,48:S238-452021/6/2718手術(shù)，抗菌藥物患者治愈血培養(yǎng)：初次：類白喉?xiàng)U菌（皮膚污染）第二次：馬紅球菌（免疫缺陷宿主的條件致病菌）最終診斷：細(xì)菌性肺炎治療：紅霉素，3個(gè)月，治愈微生物結(jié)果—條件致病菌感染診斷關(guān)鍵肺內(nèi)腫塊基本吸收SeifertH.CID,2009,48:S238-452021/6/2719醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）的微生物標(biāo)本采集和送檢要求病原檢驗(yàn)項(xiàng)目最優(yōu)標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)要求；送檢最佳時(shí)間銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌屬、粘質(zhì)沙雷菌、不動(dòng)桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌和MRSA、流感嗜血桿菌血培養(yǎng)血培養(yǎng)已經(jīng)注入標(biāo)本的培養(yǎng)瓶室溫下盡快送抵實(shí)驗(yàn)室。革蘭染色定量或半定量需氧和厭氧細(xì)菌培養(yǎng)痰；支氣管抽吸物；支氣管肺泡灌洗液；PSB；肺組織無菌杯或管，室溫，2h肺炎鏈球菌同上尿液無菌容器，室溫，2h混合厭氧菌（吸入）革蘭染色培養(yǎng)PSB標(biāo)本肺組織無菌管；無菌容器放組織；室溫，2h曲霉菌屬真菌涂片或其他真菌染色方法支氣管抽吸物無菌杯或管，室溫，2h真菌培養(yǎng)支氣管肺泡灌洗液；PSB半乳甘露聚糖（GM）1-3β-D葡聚糖（G）血清支氣管肺泡灌洗液促凝管，室溫，立即送檢無菌杯或管，室溫，2h2021/6/2720老年CAP患者的病原學(xué)診斷2011年ERS/ESCMD指南建議所有住院患者均應(yīng)進(jìn)行血培養(yǎng)北美指南建議對更嚴(yán)重的患者進(jìn)行血培養(yǎng)血培養(yǎng)有助于確診潛在的肺炎病原體和根據(jù)分離病原菌對疾病進(jìn)行重新評估血培養(yǎng)染色法呼吸樣本培養(yǎng)尿抗原檢測對初始抗生素治療方案調(diào)整具有重要的影響作用但同樣的呼吸道標(biāo)本缺乏較高的預(yù)測老年患者存在功能障礙：無法獲得可評價(jià)的痰液；口咽定植的G-菌、金黃色葡萄球菌和MDR菌較多肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌的細(xì)菌抗原采用尿免疫層析技術(shù)檢測肺炎鏈球菌抗原的敏感性約大于60%，成人患者大于90%軍團(tuán)菌抗原檢測的敏感性大于90%老年CAP患者的病原學(xué)診斷方法González-CastilloJ,etal.RevEspQuimioter.2014;27(1)：69-862021/6/272122指南中強(qiáng)調(diào)：血培養(yǎng)至少送2套

在發(fā)熱開始的24h內(nèi)進(jìn)行血培養(yǎng)。盡力保證在抗感染治療前獲得首份血培養(yǎng)標(biāo)本。同時(shí)經(jīng)2個(gè)獨(dú)立部位抽取血標(biāo)本，此結(jié)果比單一部位的血培養(yǎng)更有臨床意義。除外新生兒外，不建議只進(jìn)行單套血培養(yǎng)（Ⅱ級）。48-96h后評估治療效果，再次血培養(yǎng)不能單取1套，必須同時(shí)抽取2套標(biāo)本（Ⅱ級）。但對懷疑血管內(nèi)的感染，則應(yīng)該間隔一段時(shí)間取不同部位的靜脈穿刺抽血，有助于診斷持續(xù)性菌血癥（Ⅱ級）。CritCareMed2008Vol.36,No.4；CLSI指南；英國指南2021/6/272223“雙抽四瓶”，每瓶8-10ml

標(biāo)示“左側(cè)”、“右側(cè)”

無菌體液

如胸水等手冊宣講2021/6/2723痰標(biāo)本在病原學(xué)診斷中面臨的困難CAP患者40%以上患者無法或及時(shí)產(chǎn)生痰痰標(biāo)本合格率較低，甚至送檢唾液培養(yǎng)：痰培養(yǎng)陽性率受多種影響因素影響且影響極大，包括標(biāo)本采集、運(yùn)輸、快速處理、合理應(yīng)用細(xì)胞學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)、前期無抗生素治療、解釋技能涂片革蘭染色：最新數(shù)據(jù)表明，通過革蘭染色辨別1669個(gè)CAP住院病人合格標(biāo)本，只有14%可以辨別出主要形態(tài)類型24AmericanThoracicSociety,InfectiousDiseasesSocietyofAmerica.GuidelinesontheManagementofCommunity-AcquiredPneumoniainAdults,2007:44(Suppl2)2021/6/2724痰標(biāo)本不同外觀25唾液膿痰粘液樣痰帶血痰2021/6/272526標(biāo)本質(zhì)量評估－痰涂片Garbagein！唾液2021/6/2726一個(gè)小調(diào)查隨機(jī)調(diào)查中國15家醫(yī)院2014年痰標(biāo)本數(shù)據(jù)272021/6/2727痰標(biāo)本判讀標(biāo)準(zhǔn)的比較282021/6/2728合格痰標(biāo)本：吞噬很重要29WBC內(nèi)吞噬：葡萄球菌2021/6/2729涂片項(xiàng)目報(bào)告格式30普通細(xì)菌涂片及染色2021/6/2730

痰培養(yǎng)標(biāo)本質(zhì)量情況

總數(shù)不合格不合格率兒科9777.78%內(nèi)科2620188371.87%急診64444168.48%血液科1501102067.95%外科39726767.25%婦產(chǎn)科231356.52%門診26715056.18%ICU121555745.84%

13家醫(yī)院，痰標(biāo)本合格率不足50%2021/6/2731粒缺患者肺炎的致病菌CurrOpinPulmMed2015,21:260–2712021/6/2732對于確診IA：GM的診斷效能CurrOpinPulmMed2015,21:260–2712021/6/2733粒缺腫瘤肺炎：微生物學(xué)評價(jià)BAL是很好的診斷工具CurrOpinPulmMed2015,21:260–2712021/6/2734惡性粒細(xì)胞減少患者的肺炎診斷臨床評估+微生物學(xué)評估+分子微生物學(xué)評估：①最可靠：從無菌部位分離or呼吸道分泌物中非共生菌②BAL是首選下呼吸道標(biāo)本，越早采集越好，尤其使用抗生素之前，但不能延誤治療③支氣管活檢（TBBX）可揭示侵入血流感染，但培養(yǎng)不優(yōu)于BAL，且因?yàn)閻盒粤＜?xì)胞減少繼發(fā)血小板減少使得并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)高④分子方法：半乳甘露聚糖分子試驗(yàn)測試侵襲性曲霉病（FDA已經(jīng)批準(zhǔn)）ScottE.EvansandDavidE.Ost,Pneumoniaintheneutropeniccancerpatient,Infectiousdiseases,2015,21(3):261-2712021/6/2735日均痰標(biāo)本與BAL送檢對比362021/6/2736BAL標(biāo)本量要求生理鹽水總灌入量不少于100ml，分3-5份進(jìn)行（標(biāo)準(zhǔn)為200-240ml，分4等份進(jìn)行）好的BAL標(biāo)本，至少30%灌入液回收<30%回收率的被視作不合格，需要重新采集（尤其是<10%回收率的標(biāo)本）MeyerKC,AnofficialAmericanThoracicSocietyclinicalpracticeguideline:theclinicalutilityofbronchoalveolarlavagecellularanalysisininterstitiallungdisease,AmJRespirCritCareMed.2012May1;185(9):1004-142021/6/2737肺泡灌洗液標(biāo)本的優(yōu)點(diǎn)BALF標(biāo)本培養(yǎng)的陽性率高，合格率高BALF的采集不需要患者的配合【1】BALF能避免上呼吸道的定植菌的污染，減少對培養(yǎng)結(jié)果判斷的干擾。381.AmericanThoracicSociety,InfectiousDiseasesSocietyofAmerica.GuidelinesontheManagementofCommunity-AcquiredPneumoniainAdults,2007:44(Suppl2)2021/6/2738肺泡灌洗液標(biāo)本的處理39將所有標(biāo)本裝入50ml離心管內(nèi)漩渦震蕩30-60s每個(gè)平板定量涂10μLUsepipette.用吸管吸取0.1ml至1mlTSB（1：10稀釋）生長出>10個(gè)菌落培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)：相同形態(tài)菌落數(shù)×103CFU/mL

制作涂片（細(xì)胞離心)血平皿巧克力平皿麥康凱平皿若用接種環(huán)密涂平板，生長的菌落數(shù)量會(huì)低于實(shí)際數(shù)量。但用L棒涂布平板計(jì)數(shù)，定量培養(yǎng)結(jié)果更準(zhǔn)確2021/6/2739肺泡灌洗液的涂片革蘭染色適量BALF標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞離心，經(jīng)自然干燥、甲醇固定或火焰快速固定3次，革蘭染色標(biāo)本質(zhì)量判斷以扁平鱗狀上皮細(xì)胞占全部細(xì)胞比例<1%為合格標(biāo)本敏感度為104個(gè)細(xì)胞/mL，若每個(gè)油鏡視野可見1個(gè)或多個(gè)細(xì)菌，報(bào)告革蘭染色形態(tài)及白細(xì)胞結(jié)果，提示此菌與活動(dòng)性肺炎相關(guān)。40PatrickRM.Manualofclinicalmicrobiology.9thed.US:ASMPress,2007:307-308中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——下呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)操作規(guī)范[S].2021/6/2740肺泡灌洗液定量培養(yǎng)的意義細(xì)菌性感染，濃度閾值104CFU/mL，低于閾值濃度時(shí)，定植可能性大;高于閾值時(shí)，感染可能性大。真菌性感染，目前沒有BAL的診斷性閾值。絲狀真菌也沒有閾值。但絲狀真菌在呼吸道分泌物中的價(jià)值遠(yuǎn)大于酵母菌屬。該類菌在EORTC/MSG指南中有“臨床診斷(probablediagnosis)”價(jià)值411.AGuidetoUtilizationoftheMicrobiologyLaboratoryforDiagnosisofInfectiousDiseases:2013RecommendationsbytheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica(IDSA)andtheAmericanSocietyforMicrobiology(ASM),2013:57(15August)2.EORTC/MSG2021/6/2741培養(yǎng)與涂片結(jié)果不符：重新讀片中華結(jié)核和呼吸雜志,2011,34(9)2021/6/2742哮喘患者：結(jié)晶和庫什曼螺旋體2021/6/2743有意義的細(xì)菌濃度值（CFU/ml）標(biāo)本有意義的濃度CFU/ml自然咳痰107誘導(dǎo)痰不確定氣管內(nèi)吸取物106支氣管肺泡灌洗液104保護(hù)性毛刷103支氣管灌洗液不做培養(yǎng)2021/6/2744FilmArrayRespiratoryPanel第一個(gè)用單個(gè)標(biāo)本同時(shí)檢測病毒和細(xì)菌性呼吸道感染的測試2min上機(jī)時(shí)間，1h周轉(zhuǎn)時(shí)間300μl樣本（鼻咽拭子即可）/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm304177.htm/the-panels/2021/6/2745征集：最想對呼吸科大夫說的話留取痰培養(yǎng)后，能否先肉眼評估一下標(biāo)本質(zhì)量送檢痰培養(yǎng)的目的是什么？微生物檢驗(yàn)報(bào)告您參考嗎？何時(shí)參考？少送痰！多采血！我們盡全力幫您找破案證據(jù)（病原菌），前提是您提供一個(gè)好的案發(fā)現(xiàn)場（合格標(biāo)本）當(dāng)您面對感染病人時(shí)，微生物室與您零距離！不要忘了病毒不要用了抗生素之后，才想起送培養(yǎng)462021/6/27462021/6/2747藥敏報(bào)告共識概要藥敏試驗(yàn)的意義和基本原則具體的專業(yè)要求特殊耐藥性和耐藥表型的審核要點(diǎn)報(bào)告形式2021/6/2748藥敏試驗(yàn)的基本原則

藥敏試驗(yàn)的前提條件實(shí)驗(yàn)室的人員能力和客觀條件檢測環(huán)節(jié)的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果可信具有解釋結(jié)果的能力，能提供臨床會(huì)診分離株應(yīng)有臨床意義檢測結(jié)果應(yīng)