第四章 抗體制藥part1課件

第四章抗體制藥第四章抗體制藥part1抗體？

1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α（甲種球蛋白）、β（乙種球蛋白）、γ球蛋白（丙種球蛋白），并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。在相當一段時間內丙種球蛋白稱為抗體的同義詞。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1抗體？

抗體是指能與相應特異性結合的具有免疫功能的球蛋白（Ig）。它是機體免疫系統(tǒng)受抗原物質刺激后，B淋巴細胞被活化、增值和分化為漿細胞合成和分泌的球蛋白。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1抗原決定簇？

是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，又稱表團，通常由5-7個氨基酸殘基或5-7個多糖殘基/核苷酸組成。抗原決定蔟是T細胞受體、B細胞受體和抗體識別結合的基本單位，他們之間的相互作用具有高度特異性。如：菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）等。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1多克隆抗體？

病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體，會給治療和診斷帶來誤差。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1單克隆抗體？1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出單克隆抗體。他們將抗體產生細胞于具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系，此細胞系能產生結構和特異性完全相同的高純度抗體。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1單克隆抗體？由一種抗原決定簇刺激機體，由一個B淋巴細胞接受該抗原所產生的抗體。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產等特點。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1以單克隆抗體作為載體的藥物可對腫瘤進行定向治療。但是，臨床應用的實踐證明，免疫導向法并沒有成功，其障礙有：①單克隆抗體均是鼠源性抗體，應用于人體內可產生人鼠抗體，加速了排斥反應，在人體內半衰期只有5~6h，難以維持有效藥物作用靶組織時間。②完整的抗體分子，即Ig的相對分子質量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1基于上述原因，需從兩個方面對單克隆抗體加以改造：①降低單克隆抗體的免疫原性。②降低單克隆抗體的相對分子質量。利用基因工程技術制備出基因工程抗體，即可達到上述目的。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1單克隆抗體藥的現(xiàn)狀抗體藥的銷售額

97年~99年由4.68億美元增長到13億美元

03年抗體類藥物總銷售額將會達到50億美元250多種抗體類藥物在臨床試驗中

1/3已進入三期臨床

1/4已通過臨床三期試驗美國市場上有種治療用的抗體藥物第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1單克隆抗體藥的現(xiàn)狀1994年，Centocor的Reopro一種血小板表面受體的單克隆抗體片段被批準用于臨床來預防治療血栓形成1997年批準上市的12種生物新藥中有2種是抗體藥1998年上市的12種新藥中有6種是抗體藥2000年又批準了Mylotarg用于治療急性髓細胞白血病的抗CD33單克隆抗體2001年已批準及預期會被批準的10多種生物新藥中，也有5種是屬于抗體類藥第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1抗體藥物市場穩(wěn)步增長第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1全球有超過200家上市或未上市公司正在研發(fā)用于臨床診斷和治療的單克隆抗體正在進行臨床試驗的抗體公司（38家）第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1當前美國治療性抗體市場第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1當前美國治療性抗體市場第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1中國抗體研究現(xiàn)狀第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備一、抗原與動物免疫二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇三、篩選陽性克隆與克隆化四、雜交瘤細胞抗體形狀的鑒定五、單克隆抗體的大量制備六、單克隆抗體的純化第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備設計方案：一個B淋巴細胞----只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細胞----能無限增殖雜種細胞第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備㈠

雜交瘤技術產生的3個技術關鍵1.B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的特性：

B淋巴細胞（Blymphocytes）：接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。

B淋巴細胞本身是一種終末分化細胞，通常不再進行細胞分裂，存活一點時間后便會死亡-----短命細胞第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備骨髓瘤細胞（myelomacells）：惡性增殖的轉化細胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠分裂和存活-----長命細胞。經篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細胞-----沒有抗體分泌物。第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備2.細胞融合技術：

第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備3.雜交瘤細胞的篩選：

第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備一、抗原與動物免疫第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備1.抗原

動物體內

抗體特異性差、純度低產量低，反應不夠靈敏2.抗原

動物體內

抗體抗原不純

抗體不純篩選單一效應B細胞不能增殖，產生大量抗體刺激效應B刺激效應B第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備動物免疫:特定目標抗原動物脾臟中B淋巴細胞B淋巴細胞大量繁殖免疫刺激能分泌針對于該抗原的特異性抗體目的：在細胞融合后獲得盡可能多的分泌針對于該目標抗原的特異性抗體的雜交瘤細胞第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備常用免疫方法：

常規(guī)免疫法

“穩(wěn)妥；優(yōu)勢克隆”脾內一次性免疫法

“省時；省抗原”

短程免疫法

“省時”

體外免疫法

“操作繁瑣”免疫途徑：皮下注射腹腔注射靜脈注射第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備常規(guī)免疫法：第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備脾內免疫法：

脾內免疫法即在麻醉條件下直接把0.1~0.2ml的抗原注入脾臟進行免疫。脾內免疫法可提高小鼠對抗原的免疫反應，節(jié)省抗原用量，細胞抗原只需105個左右，可溶性抗原只需10μg左右。第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備體外免疫法：

體外免疫法的優(yōu)點很多，所需抗原量少，一般只需幾微克，免疫期短，僅4~5天，干擾因素少，已成功的制備出針對多抗原的單克隆抗體，但融合后產生的雜交瘤細胞株不夠穩(wěn)定。第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇細胞融合方法：

病毒介導的細胞融合

PEG介導細胞融合電極融合第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備細胞懸液的制備與融合⑴

脾細胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備⑵

骨髓瘤細胞懸液的制備：于對數(shù)生長期制備⑶細胞融合：5%PEG（1000~4000），pH8.0，38℃，1min

第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備2.HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細胞混合液HAT培養(yǎng)基HT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基2weekslater1weeklater第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備三、篩選陽性克隆與克隆化常用方法：要求：簡便、快速、敏感；在短時間能檢測大量樣品

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，

ELISA）間接免疫熒光法（Indirectimmunofluorescence，IFA）

放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）雙向擴散法第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）技術原理：第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備四、克隆化常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法

80個細/96孔飼養(yǎng)細胞（feedercells）

ELISA法檢測單克隆雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備單克隆抗體（monoclonalantibody，MAb）由單一克隆的雜交瘤細胞分泌的抗體，只針對于一個抗原決定簇----單克隆抗體（monoclonalantibody，MAb）單克隆抗體優(yōu)點：高度純一高度專一應用：

疾病的論斷和治療（生物導彈）生物大分子的鑒定、定位和分離純化細胞器的鑒定、定位和分離特定細胞或病毒的鑒定、定位很分離第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：動物接種法轉瓶培養(yǎng)法細胞培養(yǎng)罐法第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備大量制備單克隆抗體的方法主要有兩種：

體外培養(yǎng)法：10μg/ml

動物體內誘生法：5~20mg/mlBALB/c小鼠優(yōu)點：操作簡便，比較經濟，所得單克隆抗體較多且效價較高。缺點：混有雜蛋白有血清培養(yǎng)法；無血清培養(yǎng)法第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備動