酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)課件

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabellingtechnique）:

是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。特點(diǎn)：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位分類：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測(cè)定。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)免疫酶測(cè)定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。

辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點(diǎn)：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測(cè)定性定量檢測(cè)：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分類：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法：組織中或細(xì)胞表面的抗原。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、原理

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是一種固相酶免疫測(cè)定的方法，目前廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的檢測(cè)。其基本原理是：將抗原或抗體固定在固相載體表面，并保持其免疫活性，再與酶標(biāo)記抗體或抗原聯(lián)結(jié)，并保持并保留酶的活性，然后加入酶反應(yīng)的底物，后者被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，反應(yīng)顏色的深淺可與相應(yīng)抗原或抗體的量相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，以辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgG抗體，與相應(yīng)抗原IgG結(jié)合，標(biāo)記的酶可催化底物（鄰苯二胺）起顯色反應(yīng)，從而指示特異性抗原抗體反應(yīng)的存在。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)二、材料：1、人IgG包被的微量酶標(biāo)反應(yīng)板，（1：1萬，1：2萬，1：4萬，1：8萬，1：16萬）2、酶標(biāo)抗人IgG抗體稀釋液、洗滌液（PH7.4，0.01MPBS-Tween20）、底物溶液，3、微量移液器、移液頭、吸水紙、洗瓶、濕盒、37℃恒溫箱等。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)三、方法：1.人IgG包被微量酶標(biāo)反應(yīng)板：取人IgG各100ul，分別加入第1至5孔，設(shè)第6孔為對(duì)照。置37℃恒溫箱2小時(shí)，取出，移入4℃冰箱過夜。取出，用洗滌液洗3次，5分鐘/次。(略）2.用含小牛血清（BSA）的PH7.4PBS封閉，置37℃恒溫箱，30分鐘，取出。用洗滌液洗3次，3~5分鐘/次。（略）3.用微量移液器吸取100ul酶標(biāo)抗人IgG抗體，分別加入第6至1孔。置濕盒中，于37℃恒溫箱中孵育30分鐘。4.取出酶標(biāo)板，用洗滌液洗3次，3~5分鐘/次。5.按第6孔至第1孔的順序，每孔各加100ul的底物溶液，置37℃恒溫箱中10-15分鐘。6.觀察顯色反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用PBS洗滌3次（將洗板液加入每孔，3min后傾去），以洗去未結(jié)合的游離酶標(biāo)抗體。不同濃度IgG100ul/孔酶標(biāo)板126543酶標(biāo)抗人IgG抗體底物觀察顯色酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)四、結(jié)果1654321~5孔，隨著包被抗原濃度降低，顏色逐漸變淡6孔（對(duì)照）無色五、結(jié)論

ELISA可簡(jiǎn)便、快速、定量地檢測(cè)抗原或抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：1、正確掌握微量移液器的使用方法：一檔取樣，二檔加樣。2、正確洗滌酶標(biāo)板：勿使洗滌液溢出，造成交叉污染洗滌后應(yīng)盡量甩干孔內(nèi)殘液。3、注意加樣順序，加樣品時(shí)應(yīng)注意從最高稀釋度逐一加至最低稀釋度。4、底物OPD有一定致癌作用，故操作時(shí)應(yīng)小心，勿使底物沾染實(shí)驗(yàn)臺(tái)等器材。5，槍頭（移液頭）忌丟入實(shí)驗(yàn)臺(tái)微生物專用的廢液缸內(nèi)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA的分類√直接法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液相中的可溶性抗原或抗體√間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二抗檢測(cè)液相中未知抗體√雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗檢測(cè)液相中的可溶性抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)SandwichELISAindirectELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA檢測(cè)抗原

Ag+Ab*?Ag-Ab*酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA檢測(cè)抗體

Ab+Ag*?Ab-Ag*酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA檢測(cè)抗體Ag+Ab1?Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*?Ag-Ab1-Ab2*

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)間接ELISA（可測(cè)多種細(xì)菌或病毒的抗體，用途廣泛）顯色

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)免疫技術(shù)：以抗原-抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對(duì)樣品中相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)記技術(shù)：將可被探測(cè)的示蹤物質(zhì)用化學(xué)方法與化合物連接。標(biāo)記免疫分析：用可微量或超微量檢測(cè)的示蹤劑標(biāo)記抗原、抗體，檢測(cè)免疫反應(yīng)結(jié)果并確定待檢物。免疫標(biāo)記技術(shù)補(bǔ)充酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)放射免疫技術(shù)免疫熒光技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)放射免疫RIA以標(biāo)記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性抗體來測(cè)定待檢樣品中抗原量。

免疫放射IRMA以過量標(biāo)記抗體與抗原非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離游離和結(jié)合標(biāo)記抗體。放射受體分析RRA放射配體結(jié)合分析RBA其它放射免疫技術(shù)－原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)二、放射免疫技術(shù)－常用的放射性核素

125I

3H射線γβ理化性

活潑

差核素豐度

>90%－半衰期60.2d12.3y標(biāo)記方法簡(jiǎn)單復(fù)雜標(biāo)記設(shè)備低廉昂貴測(cè)量條件簡(jiǎn)單復(fù)雜常用標(biāo)記核素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)熒光抗體技術(shù)熒光免疫測(cè)定均相熒光免疫測(cè)定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）

非均相熒光免疫測(cè)定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)。熒光免疫技術(shù)的類型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)熒光抗體技術(shù)的基本原理

熒光素標(biāo)記抗體與切片中組織細(xì)胞抗原反應(yīng)，洗滌分離后熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復(fù)合物及其部位，對(duì)組織細(xì)胞抗原進(jìn)行定性和定位檢測(cè)，或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)行定性和滴度測(cè)定。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Immunofluorescence,IF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)熒光顯微鏡

利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測(cè)。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)病原體檢測(cè)寄生蟲（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲）細(xì)菌（藤黃微球菌)熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)免疫病理檢測(cè)腫瘤（人肝癌細(xì)胞）熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)主要試劑:

酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)：

免疫學(xué)活性酶對(duì)底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性酶免疫測(cè)定法原理及特點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析

原理及特點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶常用酶酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相非均相固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位

液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量酶免疫技術(shù)的分類酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)堿性磷酸酶（AP）

菌源性AP腸粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫測(cè)定

常用酶酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種

H2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體的專一性很高

常用底物酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)HRP的常見底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS常用底物酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)AP的底物

β-Gal的底物

對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405nm。

酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測(cè)量。常用底物酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶免疫技術(shù)的核心組成部分

酶結(jié)合物（conjugate）酶標(biāo)記物通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

酶標(biāo)記抗體或抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234一、基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)固相的抗原或抗體

酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物）

酶反應(yīng)的底物

三個(gè)必要試劑

二、方法類型及反應(yīng)原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：

二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測(cè)抗原的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測(cè)抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結(jié)合3、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)競(jìng)爭(zhēng)法

方法：用已知抗體包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競(jìng)爭(zhēng)與包被物結(jié)合。加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）ELISA檢測(cè)抗原的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)洗滌洗滌競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測(cè)物和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合YE酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)間接法方法

用已知抗原包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn)一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用

常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定ELISA檢測(cè)抗體的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測(cè)抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測(cè)抗體的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)競(jìng)爭(zhēng)法原理：類似檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法

應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測(cè)ELISA檢測(cè)抗體的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)捕獲法

應(yīng)用：

病原體急性感染診斷中的IgM型抗體

甲型肝炎HAV-IgM抗體

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體ELISA檢測(cè)抗體的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)捕獲法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體底物顯色

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測(cè)物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測(cè)物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)人IL-2定量酶聯(lián)檢測(cè)

BAS-ELISA(生物素-親和素ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

一、原理

ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay)是一種固相酶免疫測(cè)定的方法，廣泛應(yīng)用于各種抗原或抗體的微量檢測(cè)，其基本原理是將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原－抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，通過洗滌將固相上的抗原－抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分離，再利用各種操作方法，測(cè)定可溶性抗原或抗體。

BAS-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素(B)與親和素(A)間的高度放大作用，而建立的一種檢測(cè)系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素有非常高的親和力(結(jié)合常數(shù)高達(dá)1015M-1)。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價(jià)鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級(jí)放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)的催化作用而呈色，達(dá)到檢測(cè)未知抗原(或抗體)分子的目的。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法?？谷薎L-2單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品中的IL-2會(huì)與單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-2抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素。生物素和親和素特異性結(jié)合；抗人IL-2抗體與結(jié)合在單抗上的人IL-2結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有IL-2，辣根過氧化物酶會(huì)使無色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450nm處測(cè)OD值，IL-2濃度與OD450值之間呈正比，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)二、材料（人IL-2ELISA試劑盒）

1.1ng/ml人IL-2標(biāo)準(zhǔn)品2.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液3.生物素化抗人IL-2抗體（1:100）4.酶結(jié)合親和素（1:100）5.洗滌液6.顯色劑（過氧化氫－四甲基聯(lián)苯胺）7.終止液8.抗人IL-2單抗包被板條9.封板膠紙酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)三、操作步驟

1.包被抗體：用0.05MPH9.6碳酸鹽緩沖液將已知抗體作適當(dāng)稀釋，在每個(gè)聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜(18-24小時(shí))。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。

2.配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品：

孔號(hào)12345678NS(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.1

人IL-2(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.1

稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:256酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)3.加樣：將稀釋的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各100ul加入反應(yīng)孔1~8孔中，同時(shí)第9孔作空白孔。37℃孵育60分鐘，洗滌4次，0.5分鐘/次。

4.加B-Ab（生物素化抗IL-2