基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序2024/12/242024/12/24112021/6/271基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定（前提）（核心）（關(guān)鍵）（保證）2021/6/272一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的基因請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫(kù)中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成請(qǐng)閱讀P9第一和二兩段也可以是一些具有調(diào)控作用的因子2021/6/273一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸?kù)中獲取目的基因1.基因文庫(kù)：概念見(jiàn)P92.基因文庫(kù)的分類(lèi):種類(lèi)基因組DNA文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)（先建立基因文庫(kù)，再?gòu)闹泻Y選；）2021/6/274提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)3、構(gòu)建基因文庫(kù)（1）構(gòu)建基因組文庫(kù)2021/6/275某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接cDNA文庫(kù)反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（2）構(gòu)建cDNA文庫(kù)3.構(gòu)建基因文庫(kù)2021/6/276基因組文庫(kù)和部分基因組文庫(kù)(cDNA文庫(kù))比較注意：基因文庫(kù)中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。2021/6/2774、從基因文庫(kù)直接獲取目的基因怎樣從基因文庫(kù)中獲取目的基因呢？（1）獲取目的基因的根據(jù)：如：根據(jù)基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色體上的位置；基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA；

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。2021/6/2784、從基因文庫(kù)直接獲取目的基因（2）用DNA探針從基因文庫(kù)中獲取目的基因不需要模板，但需要知道序列，來(lái)構(gòu)建探針。2021/6/2792021/6/27102021/6/27114、從基因文庫(kù)直接獲取目的基因（2）用DNA探針從基因文庫(kù)中獲取目的基因不需要模板，但需要知道序列，來(lái)構(gòu)建探針。也可以用PCR方式從基因文庫(kù)中獲取目的基因2021/6/2712為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？直接從含目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過(guò)PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。2021/6/2713（二）、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因2021/6/2714（二）、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。以便合成引物。原理：利用DNA雙鏈復(fù)制原理2021/6/2715

過(guò)程：變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合延伸：加熱至70～75℃在Taq酶作用下，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性退火延伸注意：雙鏈DNA中，G和C比例越高，DNA變性溫度越高。2021/6/2716（二）、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因2021/6/2717①概念：PCR全稱為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制有一段已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增二、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因2021/6/2718⑥過(guò)程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。

c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物處延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈2021/6/2719PCR技術(shù)DNA復(fù)制過(guò)程DNA變性（90～95℃）→退火（復(fù)性55~60℃）→子鏈延伸（70~75℃）→重復(fù)循環(huán)DNA復(fù)制起始，RNA引物形成→DNA片段生成→RNA引物水解→完整的DNA分子形成相同點(diǎn)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)條件模板、原料、能量、酶、引物等不同點(diǎn)解旋方式氫鍵在高溫下斷裂，雙鏈全部解開(kāi)解旋酶催化氫鍵逐步斷裂場(chǎng)所體外主要在細(xì)胞核中引物DNARNA酶熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）解旋酶、DNA聚合酶等結(jié)果在短時(shí)間內(nèi)形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因2024/12/24202021/6/272033.(8分)請(qǐng)回答基因工程方面的有關(guān)問(wèn)題：（1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基本因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類(lèi)似（如下圖所示）。圖中引物中為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。“漢水丑生的生物同行”超級(jí)群大型公益活動(dòng)：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。2021/6/2721①?gòu)睦碚撋贤茰y(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占比例為

。②在第

輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。15/16三“漢水丑生的生物同行”超級(jí)群大型公益活動(dòng)：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。2021/6/2722模板DNA95℃2021/6/2723PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物2021/6/2724PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶2021/6/2725PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始2021/6/2726PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq2021/6/2727PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束2021/6/27282021/6/2729（2）設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）都不合理（如下圖），請(qǐng)分別說(shuō)明理由。第一組：①_______________________________________②_____________________________________引物I和引物II局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效引物I′自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效“漢水丑生的生物同行”超級(jí)群大型公益活動(dòng)：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。“漢水丑生的生物同行”超級(jí)群大型公益活動(dòng)：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。2021/6/2730目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成2）人工化學(xué)合成法：（三）、人工合成目的基因（在DNA合成儀中合成）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA基因比較小，核苷酸序列已知2021/6/2731二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2021/6/2732原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)：不編碼蛋白質(zhì),能調(diào)控遺傳信息表達(dá)2024/12/24332021/6/2733真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子外顯子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子：內(nèi)含子：能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列2024/12/24342021/6/2734非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子終止子啟動(dòng)子原核真核基因的結(jié)構(gòu)2024/12/24352021/6/2735原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼2024/12/24362021/6/27362、表達(dá)載體的組成啟動(dòng)子終止子目的基因標(biāo)記基因等2021/6/2737質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種3.過(guò)程:2021/6/2738①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意2021/6/27391、構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，需用

切割含目的基因的DNA和載體。目的是。切割含目的基因的DNA和載體并非只能用同一種限制酶。2、為防止載體與目的基因自身環(huán)化，應(yīng)該怎么做？3、目的基因與載體成功連接的基礎(chǔ)是什么？4、目的基因的插入位點(diǎn)不是隨機(jī)的。目的基因的插入不能破壞載體上自身需要的基因片段，以及其上的標(biāo)記基因，且插入在啟動(dòng)子和終止子之間。5、受體細(xì)胞不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會(huì)有差異。2021/6/2740基因工程載體的構(gòu)建需要考慮的因素：（1）基因的特點(diǎn)：若來(lái)自動(dòng)物的目的基因含有內(nèi)含子，不能用于轉(zhuǎn)基因植物；若基因產(chǎn)物是糖蛋白，該基因在原核生物中的表達(dá)蛋白不具備天然的活性；（2）要選擇強(qiáng)啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子；（3）要有選擇標(biāo)記基因；2021/6/2741三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)2021/6/27421、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。2021/6/2743③過(guò)程：④優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、有效2021/6/2744（2）基因槍法（3）花粉管通道法2021/6/27452、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法②程序：2021/6/27463、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少②方法：

大腸桿菌2021/6/2747四、目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功2021/6/2748（一）、檢測(cè)1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過(guò)程:2021/6/2749DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。2021/6/2750歸納步驟2021/6/2751（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過(guò)程:

用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA2021/6/2752思考與探究：1.作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；2024/12/24532021/6/2753（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（5）有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。2024/12/24542021/6/2754思考與探究2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個(gè)抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。2024/12/24552021/6/27553.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖