ADME／T工程細(xì)胞株的構(gòu)建調(diào)研報告

11.1藥物ADME/T性質(zhì)研究的內(nèi)容 1 1 5 6 6 6 7 8 9 92.2.1MDCK細(xì)胞模型的基本特點 9 2.2.3MDCK單層細(xì)胞模型的評價 2.2.4MDCK細(xì)胞模型在藥物研究中的應(yīng)用 2.3LLC-PK1細(xì)胞模型的基本特點及 3.2藥物轉(zhuǎn)運體與藥物相互作用研究的指導(dǎo)原則 4.3.1MDCK-MDR1細(xì)胞株的構(gòu)建 株構(gòu)建及評價 4.6Bcap37-MDR1細(xì)胞模型的構(gòu)建及其評價 4.7多種轉(zhuǎn)運體蛋白共表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型 5項目展望(個人看法) 圖1藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程 1圖2一個新藥從研究開發(fā)到成功上市的基本過程 2圖3藥物研發(fā)歷程中導(dǎo)致失敗的原因分析 3圖4ADME模型在藥物研發(fā)過程中角色的轉(zhuǎn)變 3 5圖6Caco-2細(xì)胞單層模型 7 圖8SCI收錄的關(guān)于轉(zhuǎn)運體在藥動學(xué)/藥物相互作用方面的文章數(shù)量年年遞增16圖9機(jī)體主要器官藥物轉(zhuǎn)運體的功能及分布 圖10藥物轉(zhuǎn)運體細(xì)胞模型構(gòu)建的一般策略 圖11LLC-PK1-BCRP單克隆細(xì)胞的活性鑒定——Hoechst33342染色法 表1MDCK細(xì)胞與Caco-2細(xì)胞的比較 表2ABC轉(zhuǎn)運體家族 表4藥物相互作用研究相關(guān)的轉(zhuǎn)運體 1藥物ADME/T研究的概述藥物代謝動力學(xué)(Pharmacokinetics)是研究藥物的體內(nèi)過程及體內(nèi)血漿等組織藥物濃度隨時間變化規(guī)律的一門學(xué)科(圖1所示)。ADME/T是近幾年發(fā)展起來的、全新的、在細(xì)胞水平上早期進(jìn)行藥物的活性與吸收(Absorption)、分布 制藥公司年收入的20%用在新藥的研發(fā)上，全球每年在新藥上的投資超過300億美金(圖2所示)。Millionsofscreensforsolubility,stabi在先導(dǎo)化合物的篩選過程中，40%到60%的先導(dǎo)性質(zhì)檢測中被淘汰。導(dǎo)致失敗率較高的原因主要有：商業(yè)性占5%;動物實驗毒性(Tox.)過大占11%;藥效不夠占30%;人體副作用過大占10%;藥物的ADME性質(zhì)不佳學(xué)占39%(圖3所示)。全球72%的藥物研發(fā)費用被浪費在日益增長縱觀藥物發(fā)現(xiàn)的漫長歷史，藥物研究已經(jīng)經(jīng)歷了由盲目隨機(jī)的到有的放矢的、有傳統(tǒng)經(jīng)驗性的向現(xiàn)代的科學(xué)性的研究方法的轉(zhuǎn)變。90年代藥物研究策略主要采用以生物活性為主導(dǎo)的篩選模式，藥物研究遵循“分子庫——活性篩選——傳統(tǒng)QSAR模型——ADME/PK研究——毒性研究——候程(按部就班的“循環(huán)式”):而如今的藥物研究則遵循“分子庫平行篩選 候選藥物”的平行過程(齊頭并進(jìn)的“平行式”)。目前，國外制藥公司不僅在測定藥效的同時平行評價化合物的ADME/T性質(zhì)，并且建立了體外高通量篩選ADME/T技術(shù)(圖4所示)。藥物早期ADME/T性質(zhì)研究主要以人源性或人源化組織功能性蛋白質(zhì)為“藥靶”,體外研究技術(shù)與計算機(jī)模擬等方法相結(jié)合，研究藥物與體內(nèi)生物物理和生物化學(xué)屏障因素間的相互作用。藥物早期ADME/T顯示，隨著新策略和新技術(shù)的應(yīng)用，因ADME/T問題而終止新藥開發(fā)的比例下下降為11%。床成功與否的關(guān)鍵(圖5所示)。目前世界公認(rèn)的新藥研發(fā)三大平臺包括藥效學(xué)(組合化學(xué))的發(fā)展，當(dāng)代藥物探索(Drugdiscovery)研究要求采用高通量實圖5ADME/T模型在藥物研發(fā)中的價值貢獻(xiàn)批準(zhǔn)105傳統(tǒng)的藥物動力學(xué)研究模式已經(jīng)不能適應(yīng)現(xiàn)代藥物研究的要求，體外高通量ADME/T結(jié)合計算機(jī)方法稱為當(dāng)今藥物研究發(fā)展的趨勢。ADME/T構(gòu)成了當(dāng)代藥物化學(xué)研究十分重要的方面，并逐漸成為當(dāng)代藥物發(fā)現(xiàn)策略的一部分。誠如Selick教授所言：“藥物的ADME/T性質(zhì)將是今后藥物設(shè)計的首要原則中不可或缺的組成部分”。目前，一個新藥進(jìn)入市場并不是十分有效的過程，其中90%以上已經(jīng)進(jìn)入臨床研究的藥物最終由于藥代動力學(xué)和藥效學(xué)因素(如生物利用度差、異常毒性、安全性評價不當(dāng)以及藥物相互作用等)而功虧一簣。導(dǎo)致新藥發(fā)現(xiàn)如此低的成功率的一個重要原因與藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)階段的動物實驗數(shù)據(jù)相關(guān)。由于在生理和致病過程中存在著種屬間差異性，因此，在藥物開發(fā)過程中使用的實驗動物往往是不可靠的，會給我們提供大量錯誤的信息。對于這樣的情況，人們已開發(fā)出基于人體細(xì)胞和組織的體外篩選法包括高通量篩選(HTS)和ADME/T進(jìn)行藥物代謝研究，這對預(yù)測臨床前藥物的ADME/T性質(zhì)和安全性是十分重要的。ADME/T細(xì)胞培養(yǎng)模型能在一定程度上模擬體內(nèi)條件而被廣泛用在多種給藥系統(tǒng)中進(jìn)行藥物吸收機(jī)制及轉(zhuǎn)運途徑等方面的研究，尤其是對蛋白質(zhì)、多肽經(jīng)過20多年的發(fā)展，目前已有很多基于組織水平和細(xì)胞水平的ADME/T體外模型用于藥物高通量的研究，比較成熟的有用于藥物吸收研究的Caco-2細(xì)胞漿蛋白結(jié)合模型和透血腦屏障模型等。2.1Caco-2細(xì)胞模型大量、快速篩選藥物的方法之一。其中，Caco-2細(xì)胞系來源于人類結(jié)腸腺癌，Caco-2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運模型是ADME/T的典型方法之一，也是被美國FDA批準(zhǔn)的Caco-2細(xì)胞在普通培養(yǎng)條件下即可在有孔的多聚碳酸酯膜上自發(fā)的分化為腸上皮細(xì)胞單層，因此可以模擬體內(nèi)小腸上皮細(xì)胞層。Caco-2細(xì)胞具有與小腸絨毛水解酶和各種營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體。研究表明I相代謝酶CYP1A1及Ⅱ相代謝酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、B-葡糖醛酸糖苷酶及磺基轉(zhuǎn)移酶在Caco-2細(xì)胞中也存在，并保持P-糖蛋白高表達(dá)的特征。由于其形態(tài)學(xué)及生化性質(zhì)都與小腸上皮很Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于T75培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為DMEM,其中含胎牛血清、非必需氨基酸及青-鏈霉素雙抗，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。當(dāng)Caco-2細(xì)胞傳至20-30代時，將細(xì)胞接種在Transwell板的濾膜上，細(xì)胞接種密度為(basolateralside,BL)分別加入培養(yǎng)液。將細(xì)胞置于37℃,含5%CO?的培養(yǎng)箱(圖6所示)。2.1.3Caco-2單層細(xì)胞模型的評價AP側(cè)；(3)跨膜電阻(transepitheliumelectricalresistance,TEER)的測定，以確2.1.4Caco-2細(xì)胞模型在口服藥物吸收及機(jī)制研究方面的應(yīng)用在著P-gp、MRP外排系統(tǒng)及細(xì)胞色素P45腔側(cè))的轉(zhuǎn)運率，從而對主動轉(zhuǎn)運的藥物進(jìn)行研究；各種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)及代謝酶在某些特別的酶(細(xì)胞色素P450的一些同工酶)的活性與人體小腸上皮細(xì)胞的差馬丁達(dá)比狗腎細(xì)胞系(Madin-DarbyCanineKidney,MDCK)是Madins.H.和2.2.1MDCK細(xì)胞模型的基本特點早在1998年Rothen-RutishauserB等就發(fā)現(xiàn)MDCK細(xì)胞在半透膜上培養(yǎng)，來自同一志愿者十二指腸、空腸、回腸等細(xì)胞勻漿中P-gp的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)表1MDCK細(xì)胞與Caco-2細(xì)胞的比較項目來源人結(jié)腸腺癌狗腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)周期主要轉(zhuǎn)運體肽類，核苷酸和一元羧酸一元羧酸，二肽，P-gp和陽離子肽類等優(yōu)點來源于人，表達(dá)部分轉(zhuǎn)運蛋白和酶培養(yǎng)周期短，TEER值與人體小腸相近，試驗結(jié)果重現(xiàn)性較好缺點缺少黏液層，緊密連接過緊，表達(dá)的酶與小腸有差異；培養(yǎng)周期長表達(dá)轉(zhuǎn)運蛋白水平低，代謝活性低，來源于動物主要應(yīng)用主動轉(zhuǎn)運，被動轉(zhuǎn)運被動轉(zhuǎn)運MDCK細(xì)胞培養(yǎng)于T75培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為含10%FBS的MEM,在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。約3-5d細(xì)胞融合達(dá)90%后傳代，用37℃預(yù)熱的消化液(0.25%胰酶&0.02%EDTA)室溫下消化，傳代細(xì)胞密度1.5×10?個/為了確定MDCK單層細(xì)胞的完整性，可以澄清度);(2)細(xì)胞生長曲線的繪制。觀察MDCK細(xì)胞的生長狀態(tài)，細(xì)胞計數(shù)法(3)細(xì)胞單層TEER的測定；(4)通透性的測定，通常采用熒光素鈉、甘露醇、MDCK細(xì)胞系自20世紀(jì)50年代建立開始，經(jīng)過幾十年的探索，已被大多(1)腸道吸收模型?；贛DCK細(xì)胞模型的特性和優(yōu)勢，該細(xì)胞模型作為從而實現(xiàn)對基因表達(dá)產(chǎn)物在藥物吸收中所起作用的研究。HeL等利用MDCK-MDR1細(xì)胞模型研究防己諾林堿對紫杉醇雙向轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)防己諾林堿能明顯減少紫杉醇的外排，并抑制P-gp介導(dǎo)的抗藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrugresistanee-associatedprotein轉(zhuǎn)運蛋白基因后，發(fā)現(xiàn)依托泊試的分泌轉(zhuǎn)運機(jī)制涉及P-gp和MRP2轉(zhuǎn)運蛋白，但與MRP1轉(zhuǎn)運蛋白無關(guān)。PabfaDimPle等用MDCK細(xì)胞模型研究直鏈脂肪酸對左甲狀腺素鈉(Levothyroxinesodium,T4)跨上皮轉(zhuǎn)運的影響，發(fā)現(xiàn)在T4合成過程中加入低濃度的直鏈脂肪酸能明顯提高T4的通透率，且不存在任何可能導(dǎo)致生物利用度提高的毒(2)腎臟排泄模型。體外培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞之間能形成TJ、粘附連接、橋等用MDCK-MDR1模型研究了西米替丁與依曲康唑、Psc-833之間的相互作用，證實了P-gp在腎小管有機(jī)陽離子分泌中的作用。MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)運蛋白1亞型(UT-A1)基因轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)新構(gòu)成的極化細(xì)胞模型MDCK-UT-A1穩(wěn)定能表達(dá)UT-A1轉(zhuǎn)運蛋多大鼠內(nèi)髓集合管上發(fā)生的生理反應(yīng)。MDCK細(xì)胞來源于正常的腎組研發(fā)提供毒性預(yù)測信息。YehJH等用MDCK細(xì)胞研究了氯化汞的腎毒性及其機(jī)制，研究表明MDCK細(xì)胞對典型的腎毒物氯化汞特別選模型方法建立符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)規(guī)范的用藥方式是可以先行一步的。此外，因此是從天然產(chǎn)物(如中藥)中尋找具有發(fā)展前景先導(dǎo)化合物工作的重要方面。圖7簡示了基于中藥的ADME/T性質(zhì)研究，為開發(fā)始創(chuàng)性候選中藥及中藥復(fù)方腸內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)化小腸吸收轉(zhuǎn)化體內(nèi)分布肝臟代謝/解毒/毒性膽汁排除Caco-2細(xì)胞模型藥物-血漿蛋白結(jié)合模型體外血腦屏障模型原代謝肝細(xì)胞/肝微粒體模型究熱潮(圖8所示)。從藥物研發(fā)和臨床的觀點上看，藥物轉(zhuǎn)運體的重要性在于其與藥物有效性和安全性密切相關(guān)。因為它不僅直接干預(yù)藥物的藥代動力學(xué) 0資料來源：Pubmed(統(tǒng)計到2014年1月)而影響藥物的治療效果(如圖9所示)。給給相關(guān)蛋白(Multidrugresistancerelatedprotein,MRP)和乳腺癌耐藥蛋白(Breastcancerresistanceprotein,BCRP)等(如表2統(tǒng)計),他們發(fā)揮作用均要消耗ATP,等，分子量多為50-100kDa(如表3統(tǒng)計)。全稱多藥耐藥基因/P-糖蛋白AU膽鹽分泌蛋白AH多藥耐藥基因/P-糖蛋白AH乳腺癌耐藥蛋白A多藥耐藥相關(guān)蛋白1U多藥耐藥相關(guān)蛋白2A多藥耐藥相關(guān)蛋白3多藥耐藥相關(guān)蛋白4AK多藥耐藥相關(guān)蛋白5U多藥耐藥相關(guān)蛋白6U表3SLC轉(zhuǎn)運體家族全稱牛膽磺酸協(xié)轉(zhuǎn)運多肽有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽1A2有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽1B1H有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽1B32H有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運體1有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運體2K有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運體K多藥和毒化和物外排蛋白1A前列腺素轉(zhuǎn)運體U可為后續(xù)的毒性研究及臨床研究提供重要的理論依據(jù)，預(yù)測藥物可能的相互作致藥物吸收、分布、代謝、排泄和毒性(ADME/T)性質(zhì)改變。目前報道在藥物2001年日本厚生省發(fā)布了醫(yī)藥規(guī)范第813號省令2006年FDA發(fā)布指導(dǎo)原則草案2010年國際轉(zhuǎn)運體聯(lián)盟(ITC)發(fā)表了白皮書2010年歐洲醫(yī)藥管理局(EMA)發(fā)布指導(dǎo)原則草案2012年FDA發(fā)布新的指導(dǎo)原則草案其中美國FDA在2006年指南中(DrugInteractionStudies-StudyDesign,Data容；2012年美國在FDA指南中又新增了UGTs和6種轉(zhuǎn)運體(BCRP,OATP1B3,OATP1B1,OCT2,OAT1,OAT3)。2010年歐洲EMA在指導(dǎo)原酸鹽外排泵轉(zhuǎn)運體BSEP和有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運體OCT1,此時藥物相互作用研究中轉(zhuǎn)運體總數(shù)達(dá)到了9種(如表4所示)。胞之間有很好的相關(guān)性，所以MDCK細(xì)胞也用作Caco-2細(xì)胞(最少21天培養(yǎng)),MDCK和LLC-PK1細(xì)胞具有培養(yǎng)周期短的優(yōu)點，只需要5到6天。胞系的應(yīng)用中，將MDR1基因轉(zhuǎn)染至MDCK中所建立的MDCK-MDR1細(xì)胞模單克隆資料來源：藥理學(xué)報正如上述構(gòu)建方案圖中所述，經(jīng)過抗性篩選的表達(dá)藥物轉(zhuǎn)運體的單克隆細(xì)胞一般從轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)水平和功能水平來驗證穩(wěn)定高表達(dá)轉(zhuǎn)運體細(xì)胞模型(2)轉(zhuǎn)運體蛋白的表達(dá)驗證。轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)錄后翻譯加工形成蛋白才可以實現(xiàn)外排或攝取的功能。免疫熒光染色法用于轉(zhuǎn)運蛋白定量主要是4.3MDCK-MDR1細(xì)胞株的構(gòu)建及評價每孔10?種于六孔板中，培養(yǎng)48h。用LipofectamineTM2000pcDNA3.1-MDR1轉(zhuǎn)染進(jìn)MDCK細(xì)胞內(nèi)，方法參考檢測P-gp的活性(也可采用Hoechst33342外排實驗)。另外，也借助RT-PCRMDCK的總RNA,用RT-PCR檢測各細(xì)胞MDR1的mRNA表達(dá)情況。從中可Westernblotting檢測P-gp的表達(dá)：抽提各單克隆細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞加入含4μmol/LRho123(P-gp的經(jīng)典熒光底物)的D100min,吸棄上清，用冰冷的磷酸鹽緩沖液PBS洗3次，吸凈剩余的PBS,每喹啉甲酸BCA蛋白試劑盒檢測每個樣品的總蛋白量。在P-gp抑制劑對4.3.3MDCK-MDR1細(xì)胞株建立的意義及應(yīng)用相關(guān)的方面，還可以進(jìn)行其他載體轉(zhuǎn)運藥物的研究。Luo等研究發(fā)現(xiàn)，在MDCK-MDR1細(xì)胞中存在Na+-依賴性維生素C轉(zhuǎn)運載體(SVCT),說明轉(zhuǎn)運子如多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP、乳腺癌耐藥蛋白BCRP等，早在20世紀(jì)90年代初，Caco-2細(xì)胞胞轉(zhuǎn)運子表達(dá)水平影響很大是Caco-2細(xì)胞兩個突出的缺點，而中的作用，及高表達(dá)P-gp的MDCK-MDR1細(xì)胞系是一種很理想的評與I型星形膠質(zhì)細(xì)胞(typeIastrocytes,TIA)體外共培養(yǎng)易丟失部分甚細(xì)胞是作為BBB藥物透過快速篩選的理想模型。Madgula等以和前胡醇當(dāng)歸酯(decursinolangelate)透過BBB的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cen作用組胺拮抗劑(西替立嗪、氯雷他定)是P-gp的底物，限制了大腦4.4LLC-PK1-BCRP細(xì)胞株的構(gòu)建及其評價篩選了BCRP蛋白的底物和抑制劑以及研究BCRP基因的多態(tài)性。4.4.2LLC-PK1-BCRP細(xì)胞株的生物學(xué)特征及功能性檢測Hoechst33342的外排作用，并以GF120918為BCRP抑制劑觀察其對BCRP外瞬轉(zhuǎn)pcDNA3.1-BCRP質(zhì)粒的LLC-PK1細(xì)胞)。圖中A和C為用Hoechst33342 了很多倍(流式細(xì)胞儀分選)。4.4.3