DB4505T 0010-2023 島礁石斑魚生態(tài)增殖技術(shù)規(guī)范

4505TechnicalspecificationforecologicI前言 III 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14海域及容量選擇 24.1海域自然條件 24.2增殖容量 25種類選擇 26苗種繁育、規(guī)格及適應(yīng)性馴化 26.1苗種繁育 2 26.3適應(yīng)性馴化 27苗種檢驗(yàn)檢疫 37.1檢驗(yàn)資質(zhì)機(jī)構(gòu)要求 37.2抽檢原則與數(shù)量要求 37.3檢驗(yàn)內(nèi)容與方法 38苗種原生性鑒定 38.1用于微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)的樣品采集 38.2樣品采集、運(yùn)輸與保藏條件 3 38.4微衛(wèi)星基因分型方法 38.5統(tǒng)計(jì)分析 48.6原生性判定 49生態(tài)增殖 49.1苗種類型 49.2增殖放流方法 49.3苗種比例及放流要求 410增殖效果評(píng)估 410.1基于標(biāo)志石斑魚的增殖效果評(píng)估 4 510.3基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的增殖效果評(píng)估 5 5附錄A(規(guī)范性)石斑魚生態(tài)增殖放流情況記錄表 6附錄B(資料性)環(huán)境DNA的調(diào)查方法 7 7 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定廣西精工海洋科技有限公司、湛江市東海島東方實(shí)業(yè)有1島礁石斑魚生態(tài)增殖技術(shù)規(guī)范GB/T18654.2養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第2部分：GB/T20361水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法GB31656.13食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)GB/T34748.7水產(chǎn)種質(zhì)資源基因組DNA的微衛(wèi)星分析第7部分：NY5070無(wú)公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量農(nóng)業(yè)部公告第1125號(hào)一、二、三類動(dòng)物疫病病種目錄（水生動(dòng)生態(tài)增殖ecologicalenhanc適應(yīng)性馴化adaptivedome24海域及容量選擇4.1海域自然條件b)溶解氧≥5mg/L,鹽度22～35,水溫22℃~33℃。4.2增殖容量5種類選擇6苗種繁育、規(guī)格及適應(yīng)性馴化6.1苗種繁育定的方法進(jìn)行，培育期間應(yīng)做好培育過(guò)程的采樣分析和觀測(cè)數(shù)據(jù)記錄，主要包括海水理化因子(水溫、溶解氧、pH、鹽度、氨氮和有機(jī)質(zhì)等)、投喂的飼料類型(或活餌種類)、飼料粒徑(飼料號(hào)數(shù))、苗6.3適應(yīng)性馴化a)苗種放流前14d~28d宜模擬增殖海域的水溫、鹽度等環(huán)境條件對(duì)苗種進(jìn)行馴化；37苗種檢驗(yàn)檢疫規(guī)格合格率≥90%以上，死亡個(gè)體比例、傷殘率其它到無(wú)公害食品類標(biāo)準(zhǔn)8.1.1原生種：在放流物種分布的海域內(nèi)隨機(jī)抽樣，數(shù)量為50尾～60尾。8.1.2待檢苗種群體：隨機(jī)抽樣，每批次取樣50尾～60尾。10mL離心管中的無(wú)水乙醇更換一次，放入-80℃或-20℃低溫冰箱長(zhǎng)期保存。8.3DNA提取按常規(guī)酚-氯仿法提取總DNA,放入-80℃或-20℃低溫冰箱長(zhǎng)期保存。8.4微衛(wèi)星基因分型方法4利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析軟件GeneMapper和Cervus進(jìn)行遺傳多樣性和基因流分析。8.6原生性判定當(dāng)待檢苗種群體與原生種群體間不存在顯著遺傳差異(P>0.05),可判定待檢苗種群體與本地群體存在明顯基因交流，屬于同一種群來(lái)源。9生態(tài)增殖9.1苗種類型9.1.1未標(biāo)志石斑魚苗種未進(jìn)行過(guò)任何標(biāo)志處理的石斑魚苗種。9.1.2標(biāo)志石斑魚苗種采用掛牌、金屬線碼、被動(dòng)式整合雷達(dá)標(biāo)志、超聲波標(biāo)志或無(wú)線電標(biāo)志等方法進(jìn)行標(biāo)志處理的石斑魚苗種。9.2增殖放流方法9.2.1原位增殖根據(jù)島礁自然礁體結(jié)構(gòu)和生物資源、生態(tài)環(huán)境現(xiàn)狀以及擬增殖石斑魚種類的棲息習(xí)性等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，直接將規(guī)?；嘤拇笠?guī)格苗種在石斑魚原生種的棲息生境進(jìn)行增殖。9.2.2定點(diǎn)增殖將石斑魚苗種運(yùn)送到適宜石斑魚棲息的預(yù)設(shè)站位放流，進(jìn)行增殖。9.3苗種比例及放流要求標(biāo)志石斑魚占石斑魚總放流量的比例宜為5%～10%。標(biāo)志石斑魚群體與未標(biāo)志群體應(yīng)在同一海域、同一站點(diǎn)和同一時(shí)間進(jìn)行放流。標(biāo)志與未標(biāo)志石斑魚的數(shù)量比在每一個(gè)放流站點(diǎn)應(yīng)盡量保持一致。對(duì)石斑魚的增殖放流情況應(yīng)做好記錄(見附錄A)。10增殖效果評(píng)估10.1基于標(biāo)志石斑魚的增殖效果評(píng)估10.1.1放流一年后在放流海域進(jìn)行監(jiān)測(cè)性回捕。從每個(gè)增殖放流石斑魚種類回捕樣本中各隨機(jī)抽取50尾～60尾，分別統(tǒng)計(jì)每種石斑魚抽樣樣本中標(biāo)志石斑魚的個(gè)體數(shù)，基于標(biāo)志石斑魚個(gè)體數(shù)計(jì)算石斑魚回捕占比率，見公式(1):RMA={∑i=1(Ni/Pi)]/Zi=1T}×100%………………RF—石斑魚增殖放流群體回捕占比率，用%表示：a—石斑魚增殖放流種類個(gè)數(shù)：5Pi——第i種類標(biāo)志石斑魚在該種類放流石斑魚中的占比，用％表示；T優(yōu)良差RMH≥20%＜5%按照附錄B的方法對(duì)放流海域的環(huán)境DNA進(jìn)行調(diào)查和分析，鑒定放流海域存在的石斑魚種類和相對(duì)表3基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的石斑魚生態(tài)優(yōu)良差RH≥20%＜5%斑魚的活動(dòng)和生長(zhǎng)情況，為進(jìn)一步優(yōu)化石斑魚生態(tài)增殖技術(shù)6pH7積物處取1L海水，重復(fù)取樣3次，1L去離子水作為對(duì)照。用于魚類屬、種鑒定的條形碼為12SrRNA基因，片段長(zhǎng)度為163bp～18MiFish-U-F：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’MiFish-U-R：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’在上述兩條引物中，前面的33個(gè)和34個(gè)核苷酸（nt）部分為高通量測(cè)序引物的結(jié)合位點(diǎn)，隨后的6個(gè)隨機(jī)引物（NNNNNN，如AAGGTT）用于促進(jìn)測(cè)序平臺(tái)流動(dòng)池（flowcell）DNA簇的分離，最后的21個(gè)和5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’在上述兩條引物中，8個(gè)連續(xù)X堿基代表Illumila測(cè)序技術(shù)通用的Index序列，可以用于區(qū)分不同樣連續(xù)X堿基后面的3’端序列是Illumila測(cè)8延伸15s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為第二輪PCR模板，PCR體系的采用生物信息學(xué)軟件FastQC、Cutadapt和USEARCH，對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行分析并去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)。采用QIIME2分析軟件，在97％的序列相似水平下，對(duì)高質(zhì)量的eDNA測(cè)序序列數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，去通過(guò)序列比對(duì)方法，將所有的分類單元數(shù)據(jù)與已知物種的核糖體RNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，從B.5.7.1特定石斑魚屬的相對(duì)豐度為特定石斑魚屬序列條數(shù)占全部魚類序列條數(shù)的百分比，計(jì)算見公=(?)×100%······································Rg——特定石斑魚屬相對(duì)豐度，用％表示；9B.5.7.2特定石斑魚種的相對(duì)豐度為特定石斑魚種序列條數(shù)占全部魚類序列條數(shù)的百分比，計(jì)算見公=(?)×100%·····························································(A.2)Rs——特定石斑魚種相對(duì)豐度，用％表示；基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的石斑魚增殖放流群體回捕占對(duì)于用于增殖放流的不同種類石斑魚，增殖放流前分別采集原生種群和增殖放流苗種群體樣本各50尾～60尾，回捕時(shí)分別從每種石斑魚的回捕樣本中隨機(jī)抽采用常規(guī)的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取石斑魚樣本DNA，DNA濃度≥50ng/μL，分別篩選各增殖放流石斑魚種類的高度多態(tài)性微衛(wèi)星分子標(biāo)記用于遺傳多樣性分析。按照GB/T34748.7規(guī)定的方法進(jìn)行分析，對(duì)所有增殖放流種類的石苗種群體和原生種群間的遺傳距離，如某一種類石斑魚回捕抽樣樣本與該種類增殖放流苗種群體具有相似的分子遺傳特征，且聚為一類時(shí)，可確定其為該種類增殖放流群體的回捕個(gè)統(tǒng)計(jì)每種石斑魚回捕抽樣樣本中增殖放流群體的回捕個(gè)體數(shù)，計(jì)算石斑魚增殖放流群體回捕占比）：=∑"∑!#×100%·················································(C.1)Ci——第i種類增殖放流石斑