(新版)：靶向高通量測序（tNGS）在感染性疾病中應(yīng)用與實(shí)踐專家共識

原[1-3]。兩者不同之處在于，mNGS為鳥槍法測序，無需預(yù)設(shè)待顯著減少PCR冗余擴(kuò)增導(dǎo)致的完全重復(fù)序列[4]。盡管tNGS已用一致之處，本共識不再贅述，具體可參考mNGS相關(guān)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)和專家共識[2,5-8]。一、共識制訂過程以"targetednext-genernext-generationsequencing""infection"“molecutechnology"“molecularantimicrobialsusceptibilitytesting”為關(guān)鍵萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺和維普數(shù)據(jù)庫自建庫至2024年9月的中、英文文獻(xiàn)，經(jīng)去重和同類文獻(xiàn)優(yōu)選等處理，最終納入符合本共識主題的文獻(xiàn)31本共識由執(zhí)筆小組撰寫初稿，專家組對推薦議，再由執(zhí)筆小組進(jìn)行多輪修改，形成修改稿，并進(jìn)行兩次專家評議會，第一輪評議專家22位，其中臨床專業(yè)(包括感染、呼吸、重癥專業(yè))8位，微生物學(xué)專業(yè)9位，其他專業(yè)(包括基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、公生物信息專業(yè))5位。初稿推薦共識條目38條。刪除12條爭議比較大的第二輪評議專家31位，其中臨床專業(yè)(包括感染、呼吸、重癥專業(yè))15位，微生物學(xué)專業(yè)11位，其他專業(yè)(包括基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生、生命科90%以上評議專家同意則該共識描述為“建議”;70%~90%同意則該共識(一)病原診斷適應(yīng)證方法靶標(biāo)范圍更廣[9]。肺部感染的患者中，tNGS相比傳統(tǒng)檢測方法具有更高的陽性率(96.7%比36.8%)共識2:針對不同的感染部位，建議覆蓋相應(yīng)病原譜的tNGS,比如肺部一項(xiàng)納入177名受試者201份支氣管肺泡灌洗液(BALF)標(biāo)本的研究顯和67.1%[11]。此外，102例肺部感染患者的痰液和BALF的研究陽性率(86.5%,109/126)結(jié)果顯示，培養(yǎng)、PCR和tNGS分別鑒定出13、19和62種微生物，這提示tNGS比常規(guī)檢測方法檢出了更多病原[13]。針特異性、擴(kuò)增和捕獲效率的影響。目前各廠家tNGS性能良莠不齊。臨共識4:建議根據(jù)臨床需求和醫(yī)療花費(fèi)選擇不同tNGS方法。多重PCR擴(kuò)增tNGS方法靶標(biāo)少，花費(fèi)較低，而探針捕獲tNGS方法覆蓋病原譜廣，多重PCR擴(kuò)增tNGS方法通?；谂R床已知致病病原序列設(shè)計(jì)且相比于探針捕獲法，實(shí)驗(yàn)流程相對簡單，對于臨床常見經(jīng)濟(jì)性。而探針捕獲tNGS方法的優(yōu)勢在于能夠覆蓋的基因組范圍更大，共識5:臨床高度懷疑結(jié)核分枝桿菌感染或抗酸染色陽性需鑒別非結(jié)核分在鑒別診斷方面，利用tNGS方法及時(shí)鑒別結(jié)核與其他病原體感染，對于結(jié)核病患者的早期發(fā)現(xiàn)和分診具有重要的臨床和流行病學(xué)意義[14]。tNGS有助于從(亞)種或復(fù)合群水平區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和NTM。一項(xiàng)納入370株分離株、73個(gè)種/復(fù)合群的研究顯示，tNGS與基于表型、rpoB和(或)16SrDNA一代測序的復(fù)合參比方法相比，292株結(jié)果在(亞)種或復(fù)合群水平完全一致。在103、102和101基因組拷貝的梯度稀釋條件下,tNGS成功鑒定結(jié)核分枝桿菌的比例分別為16/16、13/16和0/16,成功鑒定胞內(nèi)分枝桿菌的比例為3/3、3/3和2/3[15]。(二)微生物耐藥適應(yīng)證共識6:結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)時(shí)間長，建議tNGS用于呼2024年，WHO推薦tNGS用于結(jié)核分枝桿菌分子藥敏檢測[16]。經(jīng)細(xì)菌學(xué)確診的肺結(jié)核患者，可在呼吸道標(biāo)本(痰液、BALF等)中使用inhA、katG、embA、embB、pncA、gyrA、gyrB等),可參考WHO指南推薦[17]。經(jīng)細(xì)菌學(xué)確診的利福平耐藥肺結(jié)核患者，可在呼吸道標(biāo)本(痰液、BALF等)中使用tNGS技術(shù)檢測異煙肼、乙胺丁醇、吡素的耐藥性[16]。導(dǎo)致假敏感[18,19]。因此tNGS的使用對于早期識別潛在耐藥結(jié)力和標(biāo)本中細(xì)菌載量相關(guān)[15]。位點(diǎn)可進(jìn)行分子檢測[20],但tNGS需要積累更多證據(jù)，且應(yīng)盡可MRSA耐藥基因(mecA、mecC)VRE耐藥基因(vanA、vanB等)在部分標(biāo)本中一致[11],但實(shí)際臨床應(yīng)用尚需更多醫(yī)學(xué)證據(jù)的積累和探索。(三)流行病學(xué)和病原監(jiān)測適應(yīng)證測[24],后逐漸擴(kuò)展至人感染相關(guān)的其他病原[25]及環(huán)境樣本的監(jiān)測[26,27]。上述tNGS共識9:建議tNGS引物或探針設(shè)計(jì)遵循特異、保守、堿基均勻的原則，引物/探針及目的片段大小應(yīng)控制在適當(dāng)?shù)姆秶?，如擴(kuò)增子長度宜在200bp內(nèi)，探針長度宜介于80~120bp。引物和探針需完成干實(shí)驗(yàn)和濕實(shí)驗(yàn)特異性的區(qū)域。優(yōu)選指南、共識或文獻(xiàn)中推薦的含量為40%~60%,避免出現(xiàn)連續(xù)重復(fù)序列和嚴(yán)重的二級結(jié)構(gòu)[14],引物和探針的長度越長，引物和探針的性能評價(jià)需通過生物信息分析如采用PrimerBLAST等軟件(二)防污染措施1.實(shí)驗(yàn)室防污染措施共識10:tNGS實(shí)驗(yàn)過程中靶標(biāo)被極大富集，核酸污染風(fēng)險(xiǎn)大，建議對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、試劑、實(shí)驗(yàn)操作、廢棄物處理等制定嚴(yán)格的防污染制度和預(yù)案，并定期監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室核酸污染。場地要求建議參考已發(fā)表的專家共識和團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中的mNGS檢測病原微程的質(zhì)量控制要求可參考已發(fā)表的高通量測序?qū)＜夜沧R[29]。2.生物信息降噪措施共識11試劑工程菌、背景環(huán)境菌、環(huán)境中的氣溶膠可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。建議通過生物信息分析建立試劑和環(huán)境的基線數(shù)據(jù)庫，以提高檢測準(zhǔn)確性和可靠性。基線數(shù)據(jù)庫主要包括陰性對照基線和歷史檢測基線兩類。陰性對照基線是基于當(dāng)批陰性質(zhì)量控制(質(zhì)控)樣本檢測到微生物數(shù)據(jù)建立同批次對照基線。歷史檢測基線是基于實(shí)驗(yàn)室過往積累陰性樣本的檢出分布數(shù)據(jù)建立的對照基線。與基線數(shù)據(jù)比較，進(jìn)一步確認(rèn)檢測結(jié)果的可靠性，并定期總結(jié)本實(shí)驗(yàn)室常見環(huán)境背景菌、試劑工程菌數(shù)據(jù)庫等。共識12:tNGS檢測中引物/探針、酶等關(guān)鍵原材料或檢測流程中關(guān)鍵參數(shù)的調(diào)整可能影響檢測性能。建議每次優(yōu)化后的試劑和流程進(jìn)行性能確認(rèn)。標(biāo)本前處理方法、提取試劑、測序試劑等發(fā)生變化都會影響tNGS檢測結(jié)果。確認(rèn)滿足預(yù)期技術(shù)要求和臨床需求的檢測試劑和流程不應(yīng)輕易改變。一旦改變，應(yīng)在性能滿足預(yù)期技術(shù)要求和充分的臨床驗(yàn)證后方可使用。性能確認(rèn)時(shí)應(yīng)選用各種類型的代表性物種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，至少應(yīng)覆蓋DNA病毒、RNA病毒、細(xì)菌、真菌等，使用混合病原、同屬干擾微生物、不同濃度梯度的人源細(xì)胞和病原等確認(rèn)干擾因素。(四)質(zhì)控共識13:建議進(jìn)行全流程質(zhì)控，包含陰性對照、陽性對照、內(nèi)參、數(shù)據(jù)量、數(shù)據(jù)質(zhì)量等，且在臨床報(bào)告中體現(xiàn)質(zhì)控結(jié)果。設(shè)立質(zhì)控指標(biāo)時(shí)需要盡可能覆蓋臨床應(yīng)用的各種情況，如標(biāo)本中存在干擾物、儀器效率下降、試劑失效、操作失誤等。四、濕實(shí)驗(yàn)與干實(shí)驗(yàn)臨床標(biāo)本規(guī)范采集的要求與mNGS無差異，可參考已有專家共識和行業(yè)(一)核酸提取共識14:核酸提取試劑盒應(yīng)兼顧不同病原類型的提取效率，試劑工程菌不標(biāo)本前處理要求和核酸提取注意事項(xiàng)與mNGS無差異，建議參考已發(fā)表(二)建庫和測序共識15:根據(jù)不同癥候群、靶標(biāo)范圍、擴(kuò)增富集效率等因素確定文庫長度和最低測序數(shù)據(jù)量；測序平臺的選擇還應(yīng)考特點(diǎn)制定合適的讀長和數(shù)據(jù)量是保證分析結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵。長讀長(如≥測限95%檢出率所需要的最低序列數(shù)。(三)生物信息學(xué)分析共識16:為確保數(shù)據(jù)質(zhì)量可滿足后續(xù)分析要求，建議實(shí)驗(yàn)室對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過濾，建立生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫除常用的生物信息數(shù)據(jù)過濾軟件及流程以外，tNG特征(如常見的引物、探針的二級結(jié)構(gòu))識別或去除人源序列。此外，基于多重PCR的tNGS,應(yīng)建立引物二聚體數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行引物剪切，以避免量比對數(shù)據(jù)庫以及陽性判斷閾值建立和驗(yàn)證[14]。共識17:建議實(shí)驗(yàn)室在國際/國內(nèi)公認(rèn)的公共數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上篩選高質(zhì)量序列，建立本地化比對參考數(shù)據(jù)庫，可包括耐藥基因和毒力基因。tNGS數(shù)據(jù)庫還應(yīng)關(guān)注引物擴(kuò)增區(qū)域以及探針捕獲數(shù)據(jù)庫建立可參考團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)和專家共識[5,8]。在比對分析時(shí)，應(yīng)關(guān)注富集區(qū)段的單核苷酸多態(tài)性(SNP)變化，這些區(qū)段可能包含病原(四)陽性判斷值確定共識18:實(shí)驗(yàn)室綜合考慮標(biāo)本類型、靶標(biāo)類型、富集效率等因素，設(shè)立不陽性判斷值的確定應(yīng)包括以下步驟，(1)檢出病原二次驗(yàn)證，明確該病原體是否在標(biāo)本中真實(shí)存在：對于常見的病原體，外診斷試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證。對于相對少見、罕見的病等分子生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證。若臨床其他常規(guī)檢測進(jìn)一步驗(yàn)證。(2)陽性判斷值建立：考慮到tNGS方法學(xué)靶標(biāo)較多(通常超過100種)且覆蓋較多的罕見病原，對每種病原(特別是罕見)建立陽曲線分析以確定陽性判斷值和分析性能[14]。(3)結(jié)合影像學(xué)、病理學(xué)和臨床診斷等復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)，綜合判斷該病原的斷性能。共識19:實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立用于監(jiān)測和管理生物信息學(xué)分析程序、流程及數(shù)據(jù)共識20:實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對生物信息分析的結(jié)果進(jìn)行解釋和驗(yàn)證，包括解釋檢出共識21:測序數(shù)據(jù)可考慮以fastq或bam格式雙份存儲于不同的儲存介五、報(bào)告發(fā)放與解讀比mNGS,在報(bào)告發(fā)放和解讀的過程中應(yīng)額外考慮tNGS的病原覆蓋范圍報(bào)告發(fā)放與解讀的關(guān)鍵步驟包括：基于質(zhì)控信息判微生物注解致病性分級、責(zé)任病原體臨床判基因信息判讀、多學(xué)科會診和總結(jié)(必要時(shí))。(一)報(bào)告發(fā)放2.病原微生物注解致病性分級共識22:建議對報(bào)出的微生物致病性給出初步注解，分為致病性微生物、條件致病微生物或定植微生物。3.其他報(bào)告發(fā)放注意事項(xiàng)包括：報(bào)告發(fā)放人員應(yīng)熟悉病原微生物的生物學(xué)特性，可檢索與患者感染相關(guān)的信息，結(jié)合病原解析庫發(fā)放報(bào)告，及時(shí)與臨床醫(yī)師溝通討論，建立快速便捷反饋通道。(二)責(zé)任病原體臨床判讀和處置1.責(zé)任病原體臨床判讀共識23:建議結(jié)合標(biāo)本類型、病原種類、均一化序列數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行報(bào)告解讀，在臨床信息基礎(chǔ)上判斷該病原的致病等級。理論上，針對不同癥候群的tNGS在設(shè)計(jì)時(shí)已排除不相關(guān)的微生物，但仍有部分靶標(biāo)微生物檢出卻不一定致病，需要綜合臨床信息判斷。如遇罕見/少見病原，可查詢文獻(xiàn)、CAP-CHINA等網(wǎng)站，尋找文獻(xiàn)支持；并及時(shí)與臨床溝通，詢問相關(guān)接觸史、旅行史等信息。對于高致病性或常規(guī)方法檢測困難的微生物，如結(jié)核分枝桿菌、諾卡菌屬、隱球菌屬、毛霉菌等，檢出序列數(shù)較低，也需要考慮其為致病微生物的可能性，必要時(shí)可尋求其他臨床證據(jù)。應(yīng)注意，不同標(biāo)本的tNGS序列數(shù)不具有可比性，不能僅依靠序列數(shù)判斷感染狀態(tài)。2.責(zé)任病原體臨床處置如確定為致病微生物，根據(jù)tNGS報(bào)告的結(jié)果進(jìn)行針對性治療。積極與其他病因相鑒別，重復(fù)采樣、或送檢不同部位標(biāo)本、或更換其他(三)陰性結(jié)果臨床判讀和決策共識24:陰性結(jié)果不建議單獨(dú)作為排除依據(jù)，應(yīng)結(jié)合tNGS的靶標(biāo)覆蓋范假陰性結(jié)果常見于：(1)設(shè)計(jì)問題導(dǎo)致：t濕實(shí)驗(yàn)技術(shù)問題導(dǎo)致：破壁困難導(dǎo)致核酸未徹底釋放、微生物含量過低、標(biāo)本采樣不規(guī)范、存儲或運(yùn)輸不當(dāng)?shù)龋?3)干實(shí)驗(yàn)問題導(dǎo)致：微生物序列經(jīng)臨床判讀后仍高度懷疑感染性疾病，應(yīng)及時(shí)確認(rèn)tNGS靶標(biāo)覆蓋范圍、查看tNGS原始檢出病原列表。可在經(jīng)驗(yàn)性治療的同時(shí)完善其他檢查，必要時(shí)重復(fù)采樣、或送檢不同部位標(biāo)本、或更換其他NGS方案進(jìn)行復(fù)測(圖(四)耐藥基因判讀共識25:建議結(jié)合相對應(yīng)的病原微生物均一化序列數(shù)、耐藥機(jī)制、tNGS對于結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測，耐藥結(jié)果顯示陽性可參考依據(jù)，但耐藥結(jié)果顯示陰性應(yīng)考慮結(jié)核分對于其他細(xì)菌耐藥結(jié)果，應(yīng)考慮耐藥機(jī)制，例如檢接確定該基因是否表達(dá)，無法得出藥敏表型；需共識26:tNGS報(bào)告單建議標(biāo)注使用的tNGS方法(探針捕獲/多重PCR擴(kuò)增),并可考慮分為以下主要部分：臨床診斷、標(biāo)本信息、病原微生物特異性序列長度和致病性(掃描二維碼可瀏覽附錄1:多重PCR擴(kuò)增tNGS報(bào)告單模板),并在報(bào)告附錄中明確覆蓋的病原體及耐藥基因列表。探針捕獲tNGS方法，建議報(bào)告：病原類