多糖結合疫苗藥學研究及評價技術指導原則（試行）

(試行) 3 4 5 5 6 6（一）一般要求 6 9 （五）制劑處方及生產工藝 （一）產品質量特性研究 （五）單價結合物原液 （八）分析方法開發(fā)和驗證 多糖結合疫苗（PolysaccharideConjugateVaccine是指采用化學或其他方法將病原微生物的多糖抗原結合在載體蛋白上所制備成的多糖-蛋白結合疫苗，用于提高細菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗、腦膜炎球菌多糖結合疫苗和肺炎球菌多糖結合疫苗等。細菌多糖為T細胞非依賴性抗原（TCell-IndependentAntigen,TI-Ag多糖結合疫苗可賦予多糖抗原組分T細胞依賴性抗原（TCell-DependentAntigen,TD-Ag）特征，誘導產生的抗體可通過同種型轉換、親和力成熟和免疫記憶等功能提升疫苗的臨床有效性。多糖分子的多分散性、活化及結合位點的隨機性、化學反應對糖鏈的影響等決定了多糖抗原中間產物及結合物的不均一特征。同時由于多糖結合疫苗生產涉及多個工藝步驟，且多糖及載體蛋白的存在形式、抗原表位等在各工藝步驟中均可能發(fā)生變化并傳遞到下一步反應。因此，在整個藥學開發(fā)過程中，需關注工藝步驟對各個中間產物抗原性、均一性和質量可控性的影響，加強工藝控制及過程控制，開展全面的工藝研究及驗證，確證工藝參數對質量屬性的影響，確保批間一致性及工藝穩(wěn)健性。建議同時關注整個工藝過程中多糖/蛋白結構變化趨勢及生物學活性變化趨勢，采用理化結構解析及免疫反應表征等多種分析方法和策略綜合提升此類產品的開發(fā)水平及質量控制，并鼓勵積累構效關系相關研究數據。多糖結合物的全面結構解析尚存在技術挑戰(zhàn)，因此應建立工藝表征（ProcessCharacterization）、工藝過程控制、采用多種分析手段的綜合質控體系。多糖結合疫苗質控方法多為理化方法和免疫化學方法的組合或聯(lián)合使用，應建立靈敏、特異性強的檢測方法體系，并需根據不同工藝階段的產物特性選擇適用的方法；對于含量低或需預處理的方法，應確保檢測過程能夠反映產品的真實狀態(tài)；對于多糖含量等檢測方法，如在不同生產階段使用了不同原理的方法，應確保兩種方法具有相關性或等效性。近年來，隨著技術的發(fā)展和作用機制（B細胞表位、T細胞表位等）的研究，多糖結合疫苗未來的研究方向包括新型病原體的開發(fā)、更高價次多價疫苗或多聯(lián)疫苗的開發(fā)、新型含有更多T細胞表位或額外功能的載體蛋白開發(fā)、新型的結合方式（如，生物結合、點擊化學本指導原則適用于采用化學法制備的共價結合多糖結合疫苗及以其為組分開發(fā)的聯(lián)合疫苗。對于包含多糖結合疫苗的多價疫苗以及多聯(lián)疫苗，在進行藥學研究時應一并參考聯(lián)合疫苗的相關指導原則。對于采用新型載體蛋白，新型結合技術路線如基因工程表達的結合疫非共價結合多糖結合疫苗等，以及其它技術生產的多糖結合疫苗，在借鑒本指導原則時需根據產品相關特點和屬性開展相應研究。多糖結合疫苗藥學研究應符合《中華人民共和國藥品管理法》、和國藥典》的相關要求。臨床試驗用樣品的生產應符合現(xiàn)行版《藥品生產質量管理規(guī)范》臨床試驗用藥品（試行）附錄的相關要求。本指導原則需結合國內外其他指導原則一并應用。二、生產用菌種及種子批多糖結合疫苗的生產用菌種包括用于多糖抗原生產的菌種和用于載體蛋白生產的菌種。多糖抗原和載體蛋白生產用菌種包括天然分離菌種及經遺傳學改造菌種。對于生物合成多糖結合疫苗等技術路線使用的遺傳學改造菌種，建議根據產品特點開展更為充分的研究。華人民共和國藥典》及相關指導原則要求，明確生產用菌種來源，提供生產用菌種的來源、歷史（包括分離、鑒定、譜系圖等）、構建過程、特性和型別等研究資料。應結合多糖產物等結構確證對多糖抗原生產用菌株進行確證和鑒定，必要時可采用核磁等方法對多糖產物進行構型確認。（二）種子批應按現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》相關規(guī)定建立種子批，并提供國家藥品檢定機構相應的檢定報告。應提供各級種子的制造及檢定記錄，說明種子擴增的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、傳代方法、制備規(guī)模和保存方式，對傳代次數應嚴格限定。種子批的檢定，應根據特定菌株確定檢測項目，通常包括培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化反應、免疫學試驗、純菌檢查等；類毒素生產用菌種還包括產毒試驗和特異性中和試驗等。采用重組基因工程技術表達的重組載體蛋白生產用種子批檢定，還應對表達系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達穩(wěn)定性和生產穩(wěn)定性等的相關指標進行考察。穩(wěn)定性研究包括貯存穩(wěn)定性和傳代穩(wěn)定性，應通過貯存穩(wěn)定性研究確定種子批的保存條件，根據傳代穩(wěn)定性研究明確各級種子批的限定傳代次數。對于傳代穩(wěn)定性研究，應開展模擬傳代穩(wěn)定性研究及實際生產工藝傳代穩(wěn)定性研究，除常規(guī)種子批放行檢測外，對于基因工程構建的載體蛋白種子批，應在臨床試驗申請時盡可能提供目的基因及兩翼關鍵元件測序研究數據，并關注與載體蛋白減毒等功能相關位點的遺傳穩(wěn)定性。對于多糖生產的種子批，應結合多糖抗原的結構、分子大小及分布等評估種子批的傳代穩(wěn)定性及商業(yè)化生產的適用性，建議開展產物表達相關基因的分子遺傳學特性研究。三、培養(yǎng)基和生產用原材料多糖結合疫苗生產過程中使用的所有原材料與產品的安全性、有效性和批間一致性密切相關，包括生產過程中使用或添加的物料（如培養(yǎng)基及其添加成分、純化試劑、偶聯(lián)試劑等）等。應參照《中華人民共和國藥典》等相關要求基于風險評估的原則進行質量控制。部分原材料會對產品反應動力學、批間一致性及免疫原性等產生明顯影響，應進行充分評估，并對原材料進行適宜的預處理或建立其他適宜的控對于動物源性材料（包括在細胞庫/種子批系統(tǒng)制備過程中使用量標準等，并進行外源因子安全性（包括TSE/BSE風險）和批間一致性評估。培養(yǎng)基成分應盡可能避免使用動物源性材料，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性材料。鼓勵盡可能減少或避免動物源性原材料的使用。對于可能引入毒性的生產用原材料及其中間產物，應充分評估安全性風險。四、生產工藝載體蛋白和結合物等特性設計目標產品質量概況（QualityTargetProductProfile,QTPP綜合考慮臨床預期（臨床用途、給藥方案、劑量規(guī)格等）、質量特性、工藝路線匹配性、工藝的可控性及操作性等因素合理設計工藝路線。同時應基于產品和工藝的特點，參考國內外相關指導原則的質量風險管理理念，科學利用風險評估工具，識別并逐步確定關鍵質量屬性（CriticalQualityAttributes,CQA）和關鍵工藝參數（CriticalProcessParameters,CPP從生產工藝、質量控制和穩(wěn)定性等方面進行風險評估，根據風險評估結果，結合對產品和工藝的理解制定相應的風險控制策略。風險控制策略應貫穿于產品的全生命周期，隨著新知識、生產經驗的積累和對產品質量屬性的理解不斷更新。整體上，應圍繞中間產物和成品預期的關鍵質量屬性及工藝特點，開展工藝參數的研究和優(yōu)化。在整個生產工藝過程中，盡可能保持多糖分子的抗原決定簇、結構或者特異基團等不被顯著破壞，并實現(xiàn)預期的免疫原性。應關注全工藝過程不同工藝步驟及工藝參數對分子大小、抗原性、特異基團等的影響，為工藝路線及參數的確立提供科學依據。建議以理化指標、動物體內免疫原性等為考察指標，對關鍵工藝參數范圍、質量屬性范圍進行充分研究及表征，以確保擬定工藝的可控性和穩(wěn)健性，確保在擬定工藝參數及質量標準范圍內的產品安全性和有效性可比。以代表性型別進行工藝研究時，需明確代表性型別的選擇依據，關注型別之間的差異及擬定工藝在不同型別產品中的適在工藝研究和工藝開發(fā)過程中，應對關鍵工藝參數及其控制范圍進行建立、優(yōu)化和確認，逐步明確工藝過程控制策略。可依據工藝開發(fā)和多批次中間產物及制劑生產階段的工藝過程控制信息，擬定合理的過程控制項目及限度。非臨床研究批次與臨床研究批次應具有一定的代表性。臨床研究批次制備工藝應具備一定規(guī)模，并且還應具有一定的生產連續(xù)性和規(guī)模放大可行性。建議確證性臨床用樣品采用與擬上市產品一致的生產工藝、規(guī)模和場地，對于臨床期間的變更，需參照國內外相關指導原則進行充分的可比性研究。對于商業(yè)化生產工藝驗證，應根據產品的生產工藝和質量屬性，以風險評估的方式確定工藝驗證內容，一般包括工藝的一致性、關鍵工藝參數的穩(wěn)健性、產品相關雜質和工藝相關雜質的去除、產品質量屬性批間一致性等。執(zhí)行工藝驗證時，除常規(guī)的過程控制及放行檢測項目外，應適當增加取樣節(jié)點和測試項目，以考察工藝過程控制、中間產物及最終成品的一致性及工藝的穩(wěn)健性。建議擴展的驗證項目包括但不限于不同工藝階段產物分子量大小及其分布、特異基團保留狀此外，多糖蛋白結合疫苗生產過程通常包括多糖降解、多糖活化或衍生、載體蛋白衍生、多糖蛋白結合、未結合的活化位點封閉等一系列化學反應過程。參與反應的多糖與蛋白質均為大分子物質，各個工藝參數都有可能影響最終的結果，反應過程的一致性較大程度決定了產品質量一致性。動力學曲線研究應貫穿藥學研究的全生命周期，工藝研究時建議進行系統(tǒng)的反應動力學研究，可為關鍵工藝參數的確定提供依據；工藝確認及驗證時開展反應動力學研究，有助于評估反應過程的一致性等，從而更好的控制產品質量。多糖結合疫苗在不同生產階段可劃分為不同的生產單元（多糖生產、結合物生產等）和工藝類型，上市申請階段應固定生產架構和模式，并完成全面的工藝驗證。由于多糖性質等差異，不同群/型工藝參數不完全一致，應謹慎評估采用括號法/矩陣法進行工藝驗證的策略，并基于生產線的設置情況，合理制定商業(yè)化規(guī)模工藝驗證方案，原則上，上市前對各個型別應至少完成連續(xù)三批次驗證。對于在已上市產品中增加價次，如共有型別未發(fā)生工藝變更，可減免相應型別的相關驗證。（二）多糖抗原多糖抗原生產工藝一般包括發(fā)酵、殺菌（或除菌等）、純化等三個階段。發(fā)酵工藝，應根據菌種的生長代謝和產物生物合成途徑，合理選擇培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝。應對培養(yǎng)基成分及pH、接種比例及種子濃度、終點等進行研究與優(yōu)化，明確生產用菌種的傳代次數、制備條件和培養(yǎng)終點，加強不同批或不同培養(yǎng)罐中細菌生長及多糖表達量的一致性研究，通?？疾熘笜税ㄊ斋@終點時的菌體密度和單位體積培養(yǎng)基中的多糖產量等。建議開展細菌生長曲線和多糖表達量曲線等研究，合理確定發(fā)酵終點。細菌發(fā)酵結束后應取樣進行純菌試驗，證明發(fā)酵過程為純菌培養(yǎng)。殺菌工藝，應對殺菌劑種類和濃度、殺菌條件（溫度、時間、細菌濃度等）進行研究優(yōu)化。應進行殺菌或除菌效果研究和驗證，鼓勵在商業(yè)化規(guī)模工藝確認批進行殺菌動力學曲線研究。殺菌工藝若為細菌的自溶過程，可能產生C多糖等產品相關雜質；另外殺菌工藝也對抗原純度等存在潛在影響，建議進行殺菌工藝對多糖質量和結構的影響研究，并在工藝驗證批予以確認。純化工藝，多采用沉淀法（有機溶劑沉淀、變性沉淀、表面活性品特性合理設計純化工藝路線，根據目標產物特性和純化原理，對目標產物濃度、溫度、流速、試劑配方及濃度、pH值、離子強度、處理時間、壓力、載量等關鍵工藝參數及其控制范圍進行研究與優(yōu)化，考察各項工藝參數對多糖抗原關鍵質量屬性的影響，如分子大小、特異基團的變化等，并對目標產物回收率、產品及工藝相關雜質去除率開展研究，根據研究結果確定工藝參數及過程控制策略。對確定的生產工藝開展充分的工藝驗證，除常規(guī)放行指標外，應驗證各工藝步驟的工藝雜質去除率等，鼓勵采用核磁共振技術（NMR）等先進方法進行表征。生產過程中應控制細菌內毒素水平，對于生產用菌株為革蘭氏陰性菌的，應包含去除內毒素的工藝步驟并予以充分驗證。載體蛋白包括破傷風/白喉類毒素、細菌毒素突變體、細菌外膜蛋白等多種類型。不同載體蛋白質量屬性、可結合位點豐度、免疫原性等均存在較大差異。應提供選擇載體蛋白的依據、載體蛋白的優(yōu)勢等資料。載體蛋白應能有效的將多糖抗原由TI-Ag轉化為TD-Ag，激發(fā)機體的體液免疫和/或細胞免疫，誘導免疫記憶，不引起機體產生嚴重超敏反應。載體蛋白的種類、結構、純度、結合位點數量等均影響結合反應效率、結合物免疫原性及安全性，應綜合考慮載體蛋白對結合疫苗安全性及有效性的影響，結合原液生產工藝、質控策略、規(guī)?；a可行性等進行載體蛋白的選擇。對含結合疫苗組分的多價、多聯(lián)疫苗，還需結合成品總蛋白含量、免疫劑次等，對接種后可能產生的免疫抑制、免疫干擾、安全性影響等進行充分評估及研究，合理選擇載體蛋白種類及添加量。載體蛋白生產工藝主要包括發(fā)酵、純化等工藝步驟，應合理選擇工藝路線，以確保蛋白質氨基含量和單體蛋白純度滿足結合工藝要求?？蓞⒖碱惗舅睾突蚬こ讨亟M蛋白等相關指導原則開展工藝研究，建立全面的過程控制策略，對各工藝步驟中非目標蛋白、蛋白聚體、工藝相關雜質的去除效果及結合位點保留比例進行研究。類毒素載體蛋白因脫毒工藝會形成蛋白聚體并封閉氨基等結合位點，與其作為類毒素疫苗（如，破傷風疫苗等）組分的考慮不一致，可進行脫毒工藝的進一步優(yōu)化，在確保脫毒完全基礎上盡可能保留更多結合位點，并關注脫毒工藝的批間一致性。為確保結合物的均一性和質量可控性，應盡可能提高載體蛋白的純度，建議在傳統(tǒng)類毒素生產工藝基礎上設置有效的純化工藝以將類毒素分子大小及分布控制在一定范圍內。（四）結合物原液基于多糖抗原結構及特性、載體蛋白種類、工藝路線原理、工藝可控性、結合物免疫原性等多種因素，在保證工藝可行性、工藝可控性、免疫原性的基礎上，綜合評估并選擇適宜的工藝路線。此外，需關注各個工藝階段可能存在的副反應（SideReaction）及可能出現(xiàn)在終產品中的副產物。1、多糖降解降低黏度等另外某些多糖抗原可通過降解引入結合位點（如，末端羥基等）。通常采用物理（超聲、機械剪切）和化學（水解、氧化等）等方法進行多糖降解。此外，部分活化、衍生工藝可能伴隨多糖及分布將影響結合物的免疫原性，降解過程中由于糖鏈的斷裂可能影響特異基團的含量，因此應提供多糖降解分子大小及分布范圍的擬定依據，以多糖降解物的分子大小及分布、抗原性等關鍵質量屬性為考察指標對降解工藝路線以及工藝參數進行研究與優(yōu)化，開展降解動力學曲線研究。在工藝驗證中對多糖分子大小及分布、特異基團含量、抗原性等予以確認，建議至少采用商業(yè)化規(guī)模工藝確認批進行降解動力學曲線驗證。2、活化、衍生活化和衍生工藝是指通過對多糖或蛋白質分子的化學修飾，引入新的化學位點的過程?；罨⒀苌に嚶肪€較多且參與反應的基團和機理均不相同，應基于多糖和蛋白的結構和特性等選擇活化和/或衍生工藝，并進行相應的研究和驗證。對于反應速度較快、活性較高/易水解的化學反應等，可考慮采用適宜處理方式（如低溫條件等）開展動力學曲線等工藝表征和驗證，并鼓勵先進分析方法（如NMR、GC-MS）的使用。工藝開發(fā)過程中應評估新化學位點的引入及其數量對抗原結構和抗原性的影響，按照結合工藝需求擬定活化度、衍生率等關鍵質量屬性范圍，據此研究確定化學反應的抗原濃度、反應溶液體系、活化化、衍生動力學曲線研究，確認工藝參數與活化度或衍生率的關系。對于多糖的化學修飾，還應考慮化學反應對特異基團（如O-乙?；龋┖俊⒍嗵欠肿哟笮『涂乖缘鹊挠绊?，制定參數范圍，采取有效的工藝控制策略。對于載體蛋白的化學修飾，應考慮化學修飾過程對蛋白質單體含量的影響，避免形成過度交聯(lián)。應選擇有效的純化工藝去除工藝相關雜質，包括活化試劑、有機溶劑、淬滅劑、未被結合的間隔劑以及相關試劑的副產物等，并對生產過程中可能引入或產生的雜質進行全面評估驗證以確定純化效果。對于活化、衍生工藝的驗證，除放行檢測外，建議開展化學反應對多糖特異基團（如O-乙?；龋┖俊⒍嗵欠肿哟笮『涂乖缘鹊挠绊戲炞C；對蛋白單體含量、結合位點含量影響的驗證，建議至少采用商業(yè)化規(guī)模工藝確認批開展活化、衍生動力學曲線研究；進行雜質去除效果驗證。3、結合工藝結合工藝系將多糖和載體蛋白進行共價或非共價結合，應提供結合工藝路線選擇依據及其反應原理。工藝開發(fā)應對關鍵工藝參數及其控制范圍進行研究與確認，包括多糖蛋白投料比及反應濃度、反應pH、溫度、反應時長、終止反應條件等。應開展結合動力學曲線研究，關注活化和衍生基團的利用并優(yōu)化反應參數以降低未反應基團比例。應明確各純化工藝步驟目的，并對純化工藝的關鍵工藝參數進行研究與確認，根據結合物的關鍵質量屬性，對不同收集組分的多糖結合物進行評估，合理地確定收集組分。結合反應和純化工藝均應建立相應的過程控制策略，通過對反應參數和純化參數的監(jiān)測和控制實現(xiàn)保證結合物質量。多糖/蛋白比、結合物分子大小及分布、游離多糖、游離蛋白等關鍵質量屬性，均對免疫原性產生影響，建議在工藝開發(fā)過程中開展可覆蓋工藝及產品質量屬性變異范圍的動物免疫原性研究，以確認工結合及純化工藝驗證除常規(guī)放行檢測項目外，應對目標分子大小的單價結合物的回收率，游離蛋白、游離多糖、未結合的活化位點和工藝相關雜質的去除率等予以關注。建議至少采用商業(yè)化規(guī)模工藝確認批開展結合動力學曲線驗證，可通過游離蛋白/游離多糖-時間曲線進行工藝可控性的驗證。（五）制劑處方及生產工藝制劑中含有結合抗原、游離抗原、游離蛋白等多種組分，可能存在多種抗原、佐劑、緩沖液/輔料之間的相互作用。疫苗制劑可能需要通過抗原配制、緩沖液配制、佐劑配制、抗原-佐劑吸附、半成品配凍干等多步工藝實現(xiàn)。應提供制劑處方、工藝及其確定依據，輔料來源、質量標準及檢驗報告。表面活性劑等）、含量以及選擇的依據；可結合既往同類品種研發(fā)情況、平臺知識，通過不同制劑處方/工藝對動物藥效學研究（免疫原篩選和確定初步的制劑處方，提供相關依據。對于多價/多聯(lián)疫苗抗原含量，應對不同血清型/抗原之間的相容性開展研究，并建議對免疫原性潛在干擾予以關注。應通過非臨床研究及早期臨床研究初步確定抗原含量，并在確證性臨床試驗中予以驗證。擬上市產品的制劑處方（包括配制點、規(guī)格等）應與確證性臨床用樣品一致。制劑工藝開發(fā)應提供初步的研究資料（包括研究方法、研究結果和研究結論）以說明關鍵工藝步驟及其參數控制范圍的合理性。半成品配制工藝，對原液和輔料的加入順序及加入量、混合攪拌的速度、時間和溫度控制等參數進行研究與優(yōu)化。確保制劑過程中保持結合物的完整性和制劑的批間一致性。如為凍干制劑，應對凍干工藝的關鍵工藝參數及其控制范圍進行研究與優(yōu)化，提供凍干曲線；開展凍干工藝對凍干前后結合疫苗質量及相關特性、效力等影響的研究。如需添加佐劑，應說明添加佐劑的合理性及必要性，提供佐劑種類、用量以及與抗原的最佳配伍劑量相關研究數據。使用佐劑所帶來的潛在獲益必須超過其所帶來的風險。應參照佐劑相關指導原則提交全套的佐劑藥學研究資料，如果佐劑與抗原相互吸附，應提供吸附動力學曲線，在產品開發(fā)過程中開展各個型別結合物吸附率的相關研究。根據多糖結合疫苗工藝研究及驗證、質量標準、穩(wěn)定性考察、臨床試驗結果確定產品規(guī)格。多糖結合疫苗的產品規(guī)格原則上應與配制五、質量研究質量研究需選擇代表性批次（如非臨床研究批次、臨床研究批次和（或）商業(yè)化工藝批次等）和/或適當生產階段的樣品作為研究對象，除進行常規(guī)放行檢驗分析外，應采用適宜分析方法進行質量特性分析研究，通常包括結構特征、純度、雜質分析（工藝相關雜質及產品相關雜質）、生物學活性等研究，應提供盡可能全面的信息以反映樣品的質量屬性。鼓勵根據產品自身特點，開發(fā)更先進的分析方法，同時應關注樣品的處理和分析過程，避免預處理等分析過程對產品質量產生影響，導致分析結果無法代表樣品的實際質量。（一）產品質量特性研究1、不同階段中間產物糖鏈相關的質量特性研究（精制多糖、降解產物、活化物、衍生物、結合物原液等）糖鏈的解析高度依賴于先驗知識，如為已知多糖，可參考國內外藥典、指導原則及相關文獻開展研究；如為未知多糖，則需要進行完精制多糖、降解產物、活化物、衍生物、結合物原液等的質量特小及分布、糖鏈與載體蛋白的結合狀態(tài)（結合方式、比例、氨基酸利用率等）、產品相關雜質和工藝相關雜質殘留、安全性指標（如細菌多糖降解物的質量研究一般采用與精制多糖相同的方法，并關注相應質量屬性的變化情況?；罨?、衍生物是經過化學修飾的中間產物，應根據活化、衍生基團的物理化學特性選擇適宜的方法對修飾度予以表征。修飾度范圍應通過理化指標、生物學活性進行確認，避免對天然抗原的過度修飾?？刹捎枚炕虬攵康拿庖呋瘜W方法（如ELISA法、速率比濁法考察多糖抗原修飾前后的抗原活性變化情況,也可采用核磁共振的方法考察多糖抗原結構是否存在變化。單價結合物原液質量特性研究項目主要包括多糖/蛋白比、游離多糖、游離蛋白、分子大小及分布、糖鏈與載體蛋白的結合狀態(tài)、未反應的活化基團含量等。多糖/蛋白比、游離多糖、游離蛋白等既與結合物免疫原性相關，又是衡量批間一致性的重要指標，應采用適宜方法進行檢測。多糖和蛋白質形成結合物后，有些特異性化學基團采用原有方法難以檢測，應盡量采用其它適宜、可行的方法予以檢測。應當采用適宜方法證明單價結合物的多糖或載體蛋白上不含活化的功能基團，或者通過檢測封閉反應的產物或可監(jiān)測封閉反應以顯示未發(fā)生反應的功能基團的殘留情況，對于可能存在的方法學局限應進行充分說明。結合狀態(tài)系目前結合物解析的難點，可采用NMR、液質聯(lián)用分析（LC-MS）、氨基酸分析等方法開展研究。核磁共振技術可用于不同階段的中間產物（精制多糖、多糖降解包括單糖種類、連接方式、修飾基團等。部分多糖結合物樣品核磁解析存在技術難度，建議在臨床研究期間不斷完善相關檢測。通過對化學位移、積分、偶合常數信息的整合分析，完成對糖鏈結構的完整解析。對于已知多糖，應至少提供一維核磁圖譜，明確特征化學位移范圍及其對應的質子或化學元素，鼓勵開展二維核磁圖譜研究。定量核磁共振法整合了定量氫譜法和定量磷譜法，可高效進行精制多糖和多糖降解物中多糖、磷、以及各特異基團（糖醛酸、氨基己糖、甲基戊糖、O-乙酰基、甘油基團和丙酮酸基團等）含量的測定。應根據多糖結構和含量分析的目的，選用檢測性能足夠高的核磁共振儀，選擇適宜分析方法和樣品預處理方式進行綜合解析；對于核磁共振圖譜解析過程應建立綜合分析的手段。鼓勵采用高效液相色譜聯(lián)用多角度激光散射(HighPerformanceSizeExclusionChromatographyMultiangleLaserLightScattering,HPSEC-MALLS)、密度梯度離心等方法進行精確分子量和分子大小及分布等研究。2、載體蛋白應依據載體蛋白類型、工藝路線開展質量特性研究，關注蛋白單體含量/均一性、結合位點含量等影響結合反應的質量特性。還應對均一性、氨基含量等開展研究。重組載體蛋白，除純度、單體含量、結合位點豐度外，應按重組DNA蛋白制品要求開展質量研究，包括一級結構（氨基酸組成、游離巰基、翻譯后修飾、序列覆蓋率、質體（單體、聚體、降解片段等）開展研究。載體蛋白的純度高度依賴于檢測方法，應選用對單體和聚體分離度較好的方法，并開展對各峰組分歸屬解析等研究。部分工藝涉及衍生載體蛋白，應對衍生率和衍生過程中對單體含量、純度及工藝相關雜質殘留進行研究，鼓勵采用肽指紋圖譜、氨基酸分析等適宜方法對蛋白質衍生位點進行分析。應開展制劑工藝對結合疫苗質量特性、效力等影響的研究，包括制劑過程對結合物穩(wěn)定性影響的研究，如多糖結合物分子大小及分布、粒徑、游離糖含量變化等；如為多價疫苗或含佐劑疫苗，應開展全面的組分相容性研究，包括多個抗原、抗原-佐劑-緩沖體系之間的相容性等。對于含佐劑疫苗，建議在工藝開發(fā)過程中開展各個型別結合物的吸附狀態(tài)、吸附動力學研究、吸附率等研究。（二）雜質分析生產過程、貯存過程中產生的、和/或穩(wěn)定性研究批次中發(fā)現(xiàn)的潛在雜質，包括工藝相關雜質和產品相關雜質。對于早期臨床試驗申請，可根據來源、風險及殘留量的安全性水平等，列出潛在的產品相關雜質（建議結合毒理試驗結果、文獻資料、既往積累的科學認知以及同類產品的相關信息等綜合考慮）及工藝相關雜質，對主要雜質進行監(jiān)測與分析，必要時納入質量標準和/或進行安全性初步評價。在上市申報前需進一步進行雜質的分離、鑒別等分析研究?？紤]其在生產和貯存期間是否顯著增加及其與疫苗有效性的相關性，參考ICHQ6B的理念評估其安全性風險，確定是否納入過程控制或放行標準；對于需納入質控體系的項目應隨著研究的逐步推進加強限度標準要求。對于《中華人民共和國藥典》收納的檢項，必須符合相應標準。產品相關雜質是指生產或儲存過程中由目標產物衍生的非預期未結合產物（游離多糖、游離蛋白等）等。對于C多糖等產品相關雜質建議采用定量核磁共振法等適宜方法進行測定。工藝相關雜質是指生產過程中添加的非制劑組成部分的各種試劑殘留產生的雜質，應結合生產用原材料、生產工藝等鑒定潛在的工藝相關雜質，并根據風險進行定性和/或定量研究，評估雜質殘留的安全性風險，必要時將具有潛在安全性風險的雜質殘留納入質量標準進行控制。考慮加入的反應試劑多為有活性的試劑，部分試劑化學性質不穩(wěn)定，應依據試劑及副產物分子特性開發(fā)適宜的檢測方法。對于與疫苗關鍵質量屬性相關的工藝雜質，如因產品特性無法在成品中檢測時，應在適當的中間產物（如精制多糖、結合物等）取樣檢測，其檢測結果應能準確反映每一成品劑量中的殘留水平。（三）生物學活性生物學活性是反映產品質量和臨床有效性的重要指標，其通?？勺鳛楣に囬_發(fā)階段工藝路線、關鍵工藝參數范圍及成品制劑處方的重要參考依據，同時也是穩(wěn)定性考察中的敏感指標。體外抗原性檢測是工藝開發(fā)、工藝確認和工藝驗證中的常用手段。鼓勵建立適宜的標準血清用于考察不同階段的中間產物其抗原性、總體抗原表位等在生產過程中保留的整體情況。體內效力研究包括總抗體和功能性抗體的研究，建議進行多糖含量、總抗體、功能抗體相關性研究，選擇適宜的效力方法進行成品質控。試驗動物的種屬及品系、免疫劑量、免疫程序和免疫途徑等因素均會對免疫應答產生較大影響，因此在試驗方法開發(fā)過程中應進行充分考察及優(yōu)化。此外，隨著新技術的發(fā)展，可考慮采用糖芯片等技術進行中間產物中糖鏈的免疫活性分析、利用單克隆抗體開展糖抗原的抗原表位解析等研究。非特異性多糖、連接臂或生產過程中過度破壞的糖鏈等結構可能導致非預期的免疫學反應，鼓勵開展相關研究。六、質量標準質量標準的建立可參照《中華人民共和國藥典》、ICHQ6B和國內外相關指導原則等，根據多糖結合疫苗產品特點、生產工藝、各階段質量研究數據、批次放行檢測結果及穩(wěn)定性研究結果，結合非臨床研究和臨床研究批次綜合確定。對于一般工藝相關雜質，如經充分驗證20/30證明生產工藝可對其有效、穩(wěn)定地清除，可結合工藝進行控制，相關殘留物檢測可不列于放行檢測項目中。對于易受貯存過程影響、變化幅度較大且與產品安全、有效性相關的檢測項目，建議同時設置放行標準和貨架期標準。鼓勵采用先進的理化分析方法進行質量控制，但應提供方法的適用性驗證等資料。通常先進質控方法在不同研發(fā)階段的方法適用性驗證和不同實驗室之間的方法轉移中存在較大挑戰(zhàn)，應關注不同研發(fā)階段方法適用性驗證的差異，并采用適宜方法對方法轉移前后檢測結果的一致性進行評價。申報臨床時可根據工藝確認資料初步確定質量標準；上市階段應按照相關指導原則進行風險控制分析并基于工藝驗證情況提供完整的質量標準及方法學驗證資料。建議考慮以下質控項目：固體總量、鑒別試驗、多糖含量、特異基團含量、分子大小及分布、核酸殘留量、蛋白質殘留量、其他工藝雜質殘留、細菌內毒素、無菌等檢測。采用凍干保存的精制多糖，應對水分殘留量進行質控。對于特異基團，應提供檢測基團選擇的依據。（二）多糖降解物考慮降解多糖分子大小與后續(xù)生產工藝及結合物免疫原性密切相關，應對多糖降解物分子大小及分布進行質量控制。如在工藝開發(fā)和質量特性研究中證明多糖降解工藝對特異基團含量有影響，則需對特異基團含量進行質量控制。（三）多糖活化物、衍生物應采用適宜的方法檢測化學修飾的效果,即活化度或衍生率；另外，可采用凝膠過濾或高效液相色譜等適宜方法測定活化物、衍生物21/30的分子大小及分布，以確保多糖－蛋白結合反應的批間一致性。（四）載體蛋白若采用已有國家標準的破傷風類毒素和白喉類毒素等作為載體，應采用高效液相色譜等方法進行單體含量質控；采用適宜方法進行結合位點含量（如，氨基含量）檢測。方法學驗證中應關注所選用方法是否可有效分離載體蛋白單體、聚體，同時建議進行各采用上述以外的其它蛋白作為載體，除參照上述載體蛋白質量標準要求外，結合其自身特點及生產工藝建立相應的質量標準，比如純度、蛋白含量、細菌內毒素、宿主DNA殘留、活性/特異性毒性（如適用）等。以重組蛋白為載體的，同時應參照重組DNA蛋白制品相關要求進行質量控制，建議采用兩種不同原理的檢測方法對純度進行質結合前，對載體蛋白進行衍生處理的，應進行衍生率、純度（如單體含量、分子大小及分布等）質控，以確保批間一致性。（五）單價結合物原液不同多糖結合疫苗可能采用不同的結合工藝，但均需進行多步反應。為了確保結合物的穩(wěn)定性、安全性、有效性和批間一致性，應建立相應的質量控制方法。建議考慮以下質控項目：1、鑒別：采用適當方法進行多糖和載體蛋白的鑒別試驗。2、含量檢測：包括多糖含量、蛋白質含量等。3、多糖/蛋白比：該指標對結合物的免疫原性、一致性、穩(wěn)定性產生影響，可作為判斷結合反應的一個間接標志。如果化學結合反應過程能產生獨特的結合標志（例如某一獨特的氨基酸可通過測定22/30該標志物定量分析多糖—蛋白結合反應的程度。4、分子大小及分布：檢測方法包括已收錄《中華人民共和國藥典》的SepharoseCL-4B/CL-2B，鼓勵采用先進的方法進行分子大小及分布的放行檢測。5、產品相關雜質：包括但不限于游離多糖、游離蛋白含量等，游離多糖測定應設立試驗成功的條件，如每次沉淀游離多糖的回收率要求等。游離蛋白檢測方法包括SDS電泳、HPLC等方法。6、工藝相關雜質：應結合雜質殘留的安全風險、工藝路線和去除效果進行綜合考慮，將具有潛在安全性風險的雜質殘留納入質量標7、安全性指標：包括無菌檢查、細菌內毒素檢查。對于含佐劑的多價疫苗，如采用先添加佐劑（如，吸附等）后混合工藝，則應對吸附后單價原液的多糖含量、游離多糖含量、佐劑含量、吸附率和無菌等進行檢測。（六）半成品在充分的質量研究和工藝驗證的前提下，半成品應進行無菌檢查。（七）成品（不含多聯(lián)疫苗）建議考慮以下質控項目：產品鑒別、理化特性、含量、安全性指標、生物學活性等。凍干劑型，應對復溶用稀釋劑進行檢測。多聯(lián)疫苗應參照相關指導原則進行檢查。1、鑒別：通常采用多糖和載體蛋白的特異性抗體進行免疫學測2、理化特性：包括外觀、pH值、裝量、滲透壓摩爾濃度、分子大小及分布等。如為凍干制品，應進行水分質控。23/30量（如必要）等。如使用佐劑，應進行佐劑含量、吸附率、結合抗原含量、結合蛋白含量等質控。4、安全性指標：通常包括內毒素、異常毒性、無菌檢查等。5、生物學活性檢測：由于動物體內免疫原性檢測方法存在較大變異性，建議設立參考疫苗以適宜的比值方法擬定標準限度。不同多糖蛋白結合疫苗對試驗用動物的敏感性不同，建議結合先驗知識、藥效學研究等，合理選擇試驗用動物、免疫程序及免疫劑量等。（八）分析方法開發(fā)和驗證申請人應根據多糖結合疫苗的產品特點和工藝特點選擇合理的分析方法。成品存在型別多、糖含量低的品種，可分別或組合使用理化、免疫學方法進行全面質控。原液和成品檢測均涉及進行樣品的預處理，如游離多糖沉淀、佐劑解吸附、多糖水解為特異單糖等，預處理過程可能引入系統(tǒng)誤差，原則上，應確保預處理過程可保持產品的固有狀態(tài)或反映產品的原始狀態(tài)，獲得可接受的回收率，必要時應建立試驗成立的內控。鼓勵采用先進方法進行質控，如，采用NMR等方法對多糖鑒別、特異基團和雜質等進行質量控制；采用HPLC等方法對工藝相關雜質殘留進行檢測；采用HPSEC-MALLS等進行分子量大小及分布的質控。對于《中華人民共和國藥典》方法，應評估后進行適用性確認。自建方法應經全面驗證后根據方法檢測目的物質的不同，確認并驗證方法的準確度、精密度（包括重復性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性等指標。申報臨床時提供的方法學驗證資料應能初步證實檢測方法的適用性，分析方法的開發(fā)和驗證應隨著產品的開發(fā)和研究的不斷深入逐步優(yōu)化完善并驗證；上市階段應按照相關指導原則提供全面的方法學24/30驗證資料。研發(fā)期間若發(fā)生方法學變更或轉移，應開展相應的檢測方1、分子大小及分布應基于產品特性及生產工藝采用適宜方法客觀反映分子量大小及分布情況，所用方法應在適當的分子量范圍內具有足夠的分離度。由于不同工藝階段的產物（多糖、水解多糖、活化多糖、某些載體蛋白、結合物等）均具有分子量連續(xù)分布等特點，對于分子量大小及其分布的檢測，應關注方法分離范圍與待檢產品的適用性及產品分離度基于KD值及其回收率表征分子大小及分布的方法，應選擇能較敏感地反映產品批間一致性的KD界值，同時推薦對50%峰面積對應的KD值進行相關研究并積累數據?；贖PSEC-MALLS測定重均分子量的檢測方法，需要關注多糖結構、純度對dn/dc的影響，開展本方法與《中華人民共和國藥典》方法的相關性研究。多價疫苗成品因單價結合物抗原無法分離且含量低，可采用總抗原分子大小檢測方法，以反映總抗原的穩(wěn)定性。如有必要，應該開發(fā)單價原液特異性的分子大小檢測方法。2、多糖含量檢測通常包括化學方法、色譜法和免疫學方法的檢測，應關注以下方面1）化學方法和色譜法（如HPAEC-PAD多用于價次較少的結合疫苗，采用多糖特異基團含量進行計算，需關注各種抗原中特異性單糖或化學基團的水解及洗脫、對照品的選擇；明確對應型別的計算包括ELISA、火箭電泳、速率比濁法等。（3）單價結合物原液一般采25/30用化學法檢測多糖含量，多價多糖結合疫苗成品常采用免疫法進行多糖含量檢測，考慮兩種方法多糖含量檢測結果存在系統(tǒng)差異，建議在前期研發(fā)中對兩種方法的相關性進行充分研究及數據積累，避免因檢測方法導致擬上市產品與確證性臨床批次配制點存在差異。（4）成品抗原含量相關檢測方法，易受凍干保護劑、佐劑和表通常需要分離抗原后檢測，需進行解吸附等預處理效果等驗證。3、游離糖含量檢測結合物原液多采用脫氧膽酸鈉法、高鹽高醇析出法、氫氧化鋁凝膠結合法對游離多糖和結合多糖進行分離；多價產品因含量低、佐劑和組分干擾等因素，部分產品原液游離多糖方法在成品檢測時不適用。凍干疫苗可采用減少復溶體積的方式實現(xiàn)成品含量的富集，用以檢測游離多糖和游離蛋白。抗原含量低的多價液體/佐劑吸附疫苗，游離多糖和游離蛋白檢測方法需滿足相應的定量限或檢出限要求。應關注不同預處理方式對檢測結果的影響，建議對方法成立條件進行控制；通過加標試驗等方法學驗證證實方法學的適用性，驗證時應采用與殘留水平一致的樣品進行摻入。4、結合抗原含量/結合蛋白含量（boundantigen/boundprotein）用以表征總吸附率和總結合率，應驗證吸附成分和非吸附成分的分離效果，采用上清或沉淀含量的測定方法均可接受，如檢測方法與總抗原或蛋白檢測方法有差異，應證明方法差異不影響檢測結果。5、殘留量檢測鼓勵采用色譜法等更為敏感的方法進行相關殘留的研究。準確度驗證中應添加可覆蓋產品實際濃度范圍的標準物質行驗證。6、檢測用血清檢測用血清用于產品工藝開發(fā)、質控方法開發(fā)，是影響產品成功26/30開發(fā)的關鍵因素之一，需要關注其對多糖抗原表位保留能力的表征、特異性、效價、批間一致性、儲備量和保存穩(wěn)定性。應盡可能采用質量較高的抗原進行血清的制備。多價疫苗血清易發(fā)生抗原與血清的交叉反應，可采取適當的純化或交叉吸附以減少交叉反應，保證特異性。應對標準血清效價（或特異性抗體含量）進行質量控制，低效價血清往往無法滿足多價疫苗抗原定量檢測的要求。申請人應建立及儲備較充足的檢測用血清，同時采用適宜的保存條件，以保證其在效期內滿足檢測要求。（九）標準物質標準物質的建立和制備可參照《中華人民共和國藥典》和其它相關指導原則要求。若采用國際/國家標準物質，應明確所用的標準物質信息（來源、批次、檢定等）。若為自制標準物質，應進行制備工藝、標定、穩(wěn)定性等相關研究。建議采用確證性臨床試驗批次建立關鍵質量屬性檢測的標準物質，關注標準物質的可溯源性。由于存在多個中間產物、多種檢測方法，多糖結合疫苗檢測涉及到多種種類的標準物質。以單一成分存在的中間產物或成品，標準物質可選擇相應的單一成分或特性相似的物質。多價疫苗成品多糖抗原含量檢測的標準物質，采用化學法檢測的，標準物質應與抗原有相同的化學反應特性，如采用離子色譜法測定多糖含量時，當結合物中的多糖可被完全水解為單糖，則以單糖為標準物質，當結合物中的多糖不可被完全水解為單糖，則考慮以多糖為標準物質。采用免疫學檢測方法的，標準物質應保持穩(wěn)定的抗原性，以保證其參與抗原-抗體結合反應的穩(wěn)定性。以含多糖的抗原作為標準物質的，應采用適宜的方法對抗原含量進行賦值。應選