多糖結(jié)合疫苗藥學(xué)研究及評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）

(試行) 3 4 5 5 6 6（一）一般要求 6 9 （五）制劑處方及生產(chǎn)工藝 （一）產(chǎn)品質(zhì)量特性研究 （五）單價(jià)結(jié)合物原液 （八）分析方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證 多糖結(jié)合疫苗（PolysaccharideConjugateVaccine是指采用化學(xué)或其他方法將病原微生物的多糖抗原結(jié)合在載體蛋白上所制備成的多糖-蛋白結(jié)合疫苗，用于提高細(xì)菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗、腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗和肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗等。細(xì)菌多糖為T(mén)細(xì)胞非依賴(lài)性抗原（TCell-IndependentAntigen,TI-Ag多糖結(jié)合疫苗可賦予多糖抗原組分T細(xì)胞依賴(lài)性抗原（TCell-DependentAntigen,TD-Ag）特征，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可通過(guò)同種型轉(zhuǎn)換、親和力成熟和免疫記憶等功能提升疫苗的臨床有效性。多糖分子的多分散性、活化及結(jié)合位點(diǎn)的隨機(jī)性、化學(xué)反應(yīng)對(duì)糖鏈的影響等決定了多糖抗原中間產(chǎn)物及結(jié)合物的不均一特征。同時(shí)由于多糖結(jié)合疫苗生產(chǎn)涉及多個(gè)工藝步驟，且多糖及載體蛋白的存在形式、抗原表位等在各工藝步驟中均可能發(fā)生變化并傳遞到下一步反應(yīng)。因此，在整個(gè)藥學(xué)開(kāi)發(fā)過(guò)程中，需關(guān)注工藝步驟對(duì)各個(gè)中間產(chǎn)物抗原性、均一性和質(zhì)量可控性的影響，加強(qiáng)工藝控制及過(guò)程控制，開(kāi)展全面的工藝研究及驗(yàn)證，確證工藝參數(shù)對(duì)質(zhì)量屬性的影響，確保批間一致性及工藝穩(wěn)健性。建議同時(shí)關(guān)注整個(gè)工藝過(guò)程中多糖/蛋白結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)及生物學(xué)活性變化趨勢(shì)，采用理化結(jié)構(gòu)解析及免疫反應(yīng)表征等多種分析方法和策略綜合提升此類(lèi)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)水平及質(zhì)量控制，并鼓勵(lì)積累構(gòu)效關(guān)系相關(guān)研究數(shù)據(jù)。多糖結(jié)合物的全面結(jié)構(gòu)解析尚存在技術(shù)挑戰(zhàn)，因此應(yīng)建立工藝表征（ProcessCharacterization）、工藝過(guò)程控制、采用多種分析手段的綜合質(zhì)控體系。多糖結(jié)合疫苗質(zhì)控方法多為理化方法和免疫化學(xué)方法的組合或聯(lián)合使用，應(yīng)建立靈敏、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法體系，并需根據(jù)不同工藝階段的產(chǎn)物特性選擇適用的方法；對(duì)于含量低或需預(yù)處理的方法，應(yīng)確保檢測(cè)過(guò)程能夠反映產(chǎn)品的真實(shí)狀態(tài)；對(duì)于多糖含量等檢測(cè)方法，如在不同生產(chǎn)階段使用了不同原理的方法，應(yīng)確保兩種方法具有相關(guān)性或等效性。近年來(lái)，隨著技術(shù)的發(fā)展和作用機(jī)制（B細(xì)胞表位、T細(xì)胞表位等）的研究，多糖結(jié)合疫苗未來(lái)的研究方向包括新型病原體的開(kāi)發(fā)、更高價(jià)次多價(jià)疫苗或多聯(lián)疫苗的開(kāi)發(fā)、新型含有更多T細(xì)胞表位或額外功能的載體蛋白開(kāi)發(fā)、新型的結(jié)合方式（如，生物結(jié)合、點(diǎn)擊化學(xué)本指導(dǎo)原則適用于采用化學(xué)法制備的共價(jià)結(jié)合多糖結(jié)合疫苗及以其為組分開(kāi)發(fā)的聯(lián)合疫苗。對(duì)于包含多糖結(jié)合疫苗的多價(jià)疫苗以及多聯(lián)疫苗，在進(jìn)行藥學(xué)研究時(shí)應(yīng)一并參考聯(lián)合疫苗的相關(guān)指導(dǎo)原則。對(duì)于采用新型載體蛋白，新型結(jié)合技術(shù)路線如基因工程表達(dá)的結(jié)合疫非共價(jià)結(jié)合多糖結(jié)合疫苗等，以及其它技術(shù)生產(chǎn)的多糖結(jié)合疫苗，在借鑒本指導(dǎo)原則時(shí)需根據(jù)產(chǎn)品相關(guān)特點(diǎn)和屬性開(kāi)展相應(yīng)研究。多糖結(jié)合疫苗藥學(xué)研究應(yīng)符合《中華人民共和國(guó)藥品管理法》、和國(guó)藥典》的相關(guān)要求。臨床試驗(yàn)用樣品的生產(chǎn)應(yīng)符合現(xiàn)行版《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》臨床試驗(yàn)用藥品（試行）附錄的相關(guān)要求。本指導(dǎo)原則需結(jié)合國(guó)內(nèi)外其他指導(dǎo)原則一并應(yīng)用。二、生產(chǎn)用菌種及種子批多糖結(jié)合疫苗的生產(chǎn)用菌種包括用于多糖抗原生產(chǎn)的菌種和用于載體蛋白生產(chǎn)的菌種。多糖抗原和載體蛋白生產(chǎn)用菌種包括天然分離菌種及經(jīng)遺傳學(xué)改造菌種。對(duì)于生物合成多糖結(jié)合疫苗等技術(shù)路線使用的遺傳學(xué)改造菌種，建議根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)開(kāi)展更為充分的研究。華人民共和國(guó)藥典》及相關(guān)指導(dǎo)原則要求，明確生產(chǎn)用菌種來(lái)源，提供生產(chǎn)用菌種的來(lái)源、歷史（包括分離、鑒定、譜系圖等）、構(gòu)建過(guò)程、特性和型別等研究資料。應(yīng)結(jié)合多糖產(chǎn)物等結(jié)構(gòu)確證對(duì)多糖抗原生產(chǎn)用菌株進(jìn)行確證和鑒定，必要時(shí)可采用核磁等方法對(duì)多糖產(chǎn)物進(jìn)行構(gòu)型確認(rèn)。（二）種子批應(yīng)按現(xiàn)行版《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定建立種子批，并提供國(guó)家藥品檢定機(jī)構(gòu)相應(yīng)的檢定報(bào)告。應(yīng)提供各級(jí)種子的制造及檢定記錄，說(shuō)明種子擴(kuò)增的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、傳代方法、制備規(guī)模和保存方式，對(duì)傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格限定。種子批的檢定，應(yīng)根據(jù)特定菌株確定檢測(cè)項(xiàng)目，通常包括培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化反應(yīng)、免疫學(xué)試驗(yàn)、純菌檢查等；類(lèi)毒素生產(chǎn)用菌種還包括產(chǎn)毒試驗(yàn)和特異性中和試驗(yàn)等。采用重組基因工程技術(shù)表達(dá)的重組載體蛋白生產(chǎn)用種子批檢定，還應(yīng)對(duì)表達(dá)系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性和生產(chǎn)穩(wěn)定性等的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行考察。穩(wěn)定性研究包括貯存穩(wěn)定性和傳代穩(wěn)定性，應(yīng)通過(guò)貯存穩(wěn)定性研究確定種子批的保存條件，根據(jù)傳代穩(wěn)定性研究明確各級(jí)種子批的限定傳代次數(shù)。對(duì)于傳代穩(wěn)定性研究，應(yīng)開(kāi)展模擬傳代穩(wěn)定性研究及實(shí)際生產(chǎn)工藝傳代穩(wěn)定性研究，除常規(guī)種子批放行檢測(cè)外，對(duì)于基因工程構(gòu)建的載體蛋白種子批，應(yīng)在臨床試驗(yàn)申請(qǐng)時(shí)盡可能提供目的基因及兩翼關(guān)鍵元件測(cè)序研究數(shù)據(jù)，并關(guān)注與載體蛋白減毒等功能相關(guān)位點(diǎn)的遺傳穩(wěn)定性。對(duì)于多糖生產(chǎn)的種子批，應(yīng)結(jié)合多糖抗原的結(jié)構(gòu)、分子大小及分布等評(píng)估種子批的傳代穩(wěn)定性及商業(yè)化生產(chǎn)的適用性，建議開(kāi)展產(chǎn)物表達(dá)相關(guān)基因的分子遺傳學(xué)特性研究。三、培養(yǎng)基和生產(chǎn)用原材料多糖結(jié)合疫苗生產(chǎn)過(guò)程中使用的所有原材料與產(chǎn)品的安全性、有效性和批間一致性密切相關(guān)，包括生產(chǎn)過(guò)程中使用或添加的物料（如培養(yǎng)基及其添加成分、純化試劑、偶聯(lián)試劑等）等。應(yīng)參照《中華人民共和國(guó)藥典》等相關(guān)要求基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的原則進(jìn)行質(zhì)量控制。部分原材料會(huì)對(duì)產(chǎn)品反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、批間一致性及免疫原性等產(chǎn)生明顯影響，應(yīng)進(jìn)行充分評(píng)估，并對(duì)原材料進(jìn)行適宜的預(yù)處理或建立其他適宜的控對(duì)于動(dòng)物源性材料（包括在細(xì)胞庫(kù)/種子批系統(tǒng)制備過(guò)程中使用量標(biāo)準(zhǔn)等，并進(jìn)行外源因子安全性（包括TSE/BSE風(fēng)險(xiǎn)）和批間一致性評(píng)估。培養(yǎng)基成分應(yīng)盡可能避免使用動(dòng)物源性材料，禁止使用來(lái)自瘋牛病疫區(qū)的牛源性材料。鼓勵(lì)盡可能減少或避免動(dòng)物源性原材料的使用。對(duì)于可能引入毒性的生產(chǎn)用原材料及其中間產(chǎn)物，應(yīng)充分評(píng)估安全性風(fēng)險(xiǎn)。四、生產(chǎn)工藝載體蛋白和結(jié)合物等特性設(shè)計(jì)目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量概況（QualityTargetProductProfile,QTPP綜合考慮臨床預(yù)期（臨床用途、給藥方案、劑量規(guī)格等）、質(zhì)量特性、工藝路線匹配性、工藝的可控性及操作性等因素合理設(shè)計(jì)工藝路線。同時(shí)應(yīng)基于產(chǎn)品和工藝的特點(diǎn)，參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)指導(dǎo)原則的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理理念，科學(xué)利用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具，識(shí)別并逐步確定關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CriticalQualityAttributes,CQA）和關(guān)鍵工藝參數(shù)（CriticalProcessParameters,CPP從生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性等方面進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果，結(jié)合對(duì)產(chǎn)品和工藝的理解制定相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制策略。風(fēng)險(xiǎn)控制策略應(yīng)貫穿于產(chǎn)品的全生命周期，隨著新知識(shí)、生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)的積累和對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量屬性的理解不斷更新。整體上，應(yīng)圍繞中間產(chǎn)物和成品預(yù)期的關(guān)鍵質(zhì)量屬性及工藝特點(diǎn)，開(kāi)展工藝參數(shù)的研究和優(yōu)化。在整個(gè)生產(chǎn)工藝過(guò)程中，盡可能保持多糖分子的抗原決定簇、結(jié)構(gòu)或者特異基團(tuán)等不被顯著破壞，并實(shí)現(xiàn)預(yù)期的免疫原性。應(yīng)關(guān)注全工藝過(guò)程不同工藝步驟及工藝參數(shù)對(duì)分子大小、抗原性、特異基團(tuán)等的影響，為工藝路線及參數(shù)的確立提供科學(xué)依據(jù)。建議以理化指標(biāo)、動(dòng)物體內(nèi)免疫原性等為考察指標(biāo)，對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)范圍、質(zhì)量屬性范圍進(jìn)行充分研究及表征，以確保擬定工藝的可控性和穩(wěn)健性，確保在擬定工藝參數(shù)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的產(chǎn)品安全性和有效性可比。以代表性型別進(jìn)行工藝研究時(shí)，需明確代表性型別的選擇依據(jù)，關(guān)注型別之間的差異及擬定工藝在不同型別產(chǎn)品中的適在工藝研究和工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中，應(yīng)對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進(jìn)行建立、優(yōu)化和確認(rèn)，逐步明確工藝過(guò)程控制策略?？梢罁?jù)工藝開(kāi)發(fā)和多批次中間產(chǎn)物及制劑生產(chǎn)階段的工藝過(guò)程控制信息，擬定合理的過(guò)程控制項(xiàng)目及限度。非臨床研究批次與臨床研究批次應(yīng)具有一定的代表性。臨床研究批次制備工藝應(yīng)具備一定規(guī)模，并且還應(yīng)具有一定的生產(chǎn)連續(xù)性和規(guī)模放大可行性。建議確證性臨床用樣品采用與擬上市產(chǎn)品一致的生產(chǎn)工藝、規(guī)模和場(chǎng)地，對(duì)于臨床期間的變更，需參照國(guó)內(nèi)外相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行充分的可比性研究。對(duì)于商業(yè)化生產(chǎn)工藝驗(yàn)證，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量屬性，以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方式確定工藝驗(yàn)證內(nèi)容，一般包括工藝的一致性、關(guān)鍵工藝參數(shù)的穩(wěn)健性、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)和工藝相關(guān)雜質(zhì)的去除、產(chǎn)品質(zhì)量屬性批間一致性等。執(zhí)行工藝驗(yàn)證時(shí)，除常規(guī)的過(guò)程控制及放行檢測(cè)項(xiàng)目外，應(yīng)適當(dāng)增加取樣節(jié)點(diǎn)和測(cè)試項(xiàng)目，以考察工藝過(guò)程控制、中間產(chǎn)物及最終成品的一致性及工藝的穩(wěn)健性。建議擴(kuò)展的驗(yàn)證項(xiàng)目包括但不限于不同工藝階段產(chǎn)物分子量大小及其分布、特異基團(tuán)保留狀此外，多糖蛋白結(jié)合疫苗生產(chǎn)過(guò)程通常包括多糖降解、多糖活化或衍生、載體蛋白衍生、多糖蛋白結(jié)合、未結(jié)合的活化位點(diǎn)封閉等一系列化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。參與反應(yīng)的多糖與蛋白質(zhì)均為大分子物質(zhì)，各個(gè)工藝參數(shù)都有可能影響最終的結(jié)果，反應(yīng)過(guò)程的一致性較大程度決定了產(chǎn)品質(zhì)量一致性。動(dòng)力學(xué)曲線研究應(yīng)貫穿藥學(xué)研究的全生命周期，工藝研究時(shí)建議進(jìn)行系統(tǒng)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，可為關(guān)鍵工藝參數(shù)的確定提供依據(jù)；工藝確認(rèn)及驗(yàn)證時(shí)開(kāi)展反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，有助于評(píng)估反應(yīng)過(guò)程的一致性等，從而更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量。多糖結(jié)合疫苗在不同生產(chǎn)階段可劃分為不同的生產(chǎn)單元（多糖生產(chǎn)、結(jié)合物生產(chǎn)等）和工藝類(lèi)型，上市申請(qǐng)階段應(yīng)固定生產(chǎn)架構(gòu)和模式，并完成全面的工藝驗(yàn)證。由于多糖性質(zhì)等差異，不同群/型工藝參數(shù)不完全一致，應(yīng)謹(jǐn)慎評(píng)估采用括號(hào)法/矩陣法進(jìn)行工藝驗(yàn)證的策略，并基于生產(chǎn)線的設(shè)置情況，合理制定商業(yè)化規(guī)模工藝驗(yàn)證方案，原則上，上市前對(duì)各個(gè)型別應(yīng)至少完成連續(xù)三批次驗(yàn)證。對(duì)于在已上市產(chǎn)品中增加價(jià)次，如共有型別未發(fā)生工藝變更，可減免相應(yīng)型別的相關(guān)驗(yàn)證。（二）多糖抗原多糖抗原生產(chǎn)工藝一般包括發(fā)酵、殺菌（或除菌等）、純化等三個(gè)階段。發(fā)酵工藝，應(yīng)根據(jù)菌種的生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)物生物合成途徑，合理選擇培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝。應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基成分及pH、接種比例及種子濃度、終點(diǎn)等進(jìn)行研究與優(yōu)化，明確生產(chǎn)用菌種的傳代次數(shù)、制備條件和培養(yǎng)終點(diǎn)，加強(qiáng)不同批或不同培養(yǎng)罐中細(xì)菌生長(zhǎng)及多糖表達(dá)量的一致性研究，通?？疾熘笜?biāo)包括收獲終點(diǎn)時(shí)的菌體密度和單位體積培養(yǎng)基中的多糖產(chǎn)量等。建議開(kāi)展細(xì)菌生長(zhǎng)曲線和多糖表達(dá)量曲線等研究，合理確定發(fā)酵終點(diǎn)。細(xì)菌發(fā)酵結(jié)束后應(yīng)取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，證明發(fā)酵過(guò)程為純菌培養(yǎng)。殺菌工藝，應(yīng)對(duì)殺菌劑種類(lèi)和濃度、殺菌條件（溫度、時(shí)間、細(xì)菌濃度等）進(jìn)行研究?jī)?yōu)化。應(yīng)進(jìn)行殺菌或除菌效果研究和驗(yàn)證，鼓勵(lì)在商業(yè)化規(guī)模工藝確認(rèn)批進(jìn)行殺菌動(dòng)力學(xué)曲線研究。殺菌工藝若為細(xì)菌的自溶過(guò)程，可能產(chǎn)生C多糖等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)；另外殺菌工藝也對(duì)抗原純度等存在潛在影響，建議進(jìn)行殺菌工藝對(duì)多糖質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的影響研究，并在工藝驗(yàn)證批予以確認(rèn)。純化工藝，多采用沉淀法（有機(jī)溶劑沉淀、變性沉淀、表面活性品特性合理設(shè)計(jì)純化工藝路線，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物特性和純化原理，對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物濃度、溫度、流速、試劑配方及濃度、pH值、離子強(qiáng)度、處理時(shí)間、壓力、載量等關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進(jìn)行研究與優(yōu)化，考察各項(xiàng)工藝參數(shù)對(duì)多糖抗原關(guān)鍵質(zhì)量屬性的影響，如分子大小、特異基團(tuán)的變化等，并對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物回收率、產(chǎn)品及工藝相關(guān)雜質(zhì)去除率開(kāi)展研究，根據(jù)研究結(jié)果確定工藝參數(shù)及過(guò)程控制策略。對(duì)確定的生產(chǎn)工藝開(kāi)展充分的工藝驗(yàn)證，除常規(guī)放行指標(biāo)外，應(yīng)驗(yàn)證各工藝步驟的工藝雜質(zhì)去除率等，鼓勵(lì)采用核磁共振技術(shù)（NMR）等先進(jìn)方法進(jìn)行表征。生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)控制細(xì)菌內(nèi)毒素水平，對(duì)于生產(chǎn)用菌株為革蘭氏陰性菌的，應(yīng)包含去除內(nèi)毒素的工藝步驟并予以充分驗(yàn)證。載體蛋白包括破傷風(fēng)/白喉類(lèi)毒素、細(xì)菌毒素突變體、細(xì)菌外膜蛋白等多種類(lèi)型。不同載體蛋白質(zhì)量屬性、可結(jié)合位點(diǎn)豐度、免疫原性等均存在較大差異。應(yīng)提供選擇載體蛋白的依據(jù)、載體蛋白的優(yōu)勢(shì)等資料。載體蛋白應(yīng)能有效的將多糖抗原由TI-Ag轉(zhuǎn)化為T(mén)D-Ag，激發(fā)機(jī)體的體液免疫和/或細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)免疫記憶，不引起機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重超敏反應(yīng)。載體蛋白的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、純度、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量等均影響結(jié)合反應(yīng)效率、結(jié)合物免疫原性及安全性，應(yīng)綜合考慮載體蛋白對(duì)結(jié)合疫苗安全性及有效性的影響，結(jié)合原液生產(chǎn)工藝、質(zhì)控策略、規(guī)?；a(chǎn)可行性等進(jìn)行載體蛋白的選擇。對(duì)含結(jié)合疫苗組分的多價(jià)、多聯(lián)疫苗，還需結(jié)合成品總蛋白含量、免疫劑次等，對(duì)接種后可能產(chǎn)生的免疫抑制、免疫干擾、安全性影響等進(jìn)行充分評(píng)估及研究，合理選擇載體蛋白種類(lèi)及添加量。載體蛋白生產(chǎn)工藝主要包括發(fā)酵、純化等工藝步驟，應(yīng)合理選擇工藝路線，以確保蛋白質(zhì)氨基含量和單體蛋白純度滿足結(jié)合工藝要求?？蓞⒖碱?lèi)毒素和基因工程重組蛋白等相關(guān)指導(dǎo)原則開(kāi)展工藝研究，建立全面的過(guò)程控制策略，對(duì)各工藝步驟中非目標(biāo)蛋白、蛋白聚體、工藝相關(guān)雜質(zhì)的去除效果及結(jié)合位點(diǎn)保留比例進(jìn)行研究。類(lèi)毒素載體蛋白因脫毒工藝會(huì)形成蛋白聚體并封閉氨基等結(jié)合位點(diǎn)，與其作為類(lèi)毒素疫苗（如，破傷風(fēng)疫苗等）組分的考慮不一致，可進(jìn)行脫毒工藝的進(jìn)一步優(yōu)化，在確保脫毒完全基礎(chǔ)上盡可能保留更多結(jié)合位點(diǎn)，并關(guān)注脫毒工藝的批間一致性。為確保結(jié)合物的均一性和質(zhì)量可控性，應(yīng)盡可能提高載體蛋白的純度，建議在傳統(tǒng)類(lèi)毒素生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上設(shè)置有效的純化工藝以將類(lèi)毒素分子大小及分布控制在一定范圍內(nèi)。（四）結(jié)合物原液基于多糖抗原結(jié)構(gòu)及特性、載體蛋白種類(lèi)、工藝路線原理、工藝可控性、結(jié)合物免疫原性等多種因素，在保證工藝可行性、工藝可控性、免疫原性的基礎(chǔ)上，綜合評(píng)估并選擇適宜的工藝路線。此外，需關(guān)注各個(gè)工藝階段可能存在的副反應(yīng)（SideReaction）及可能出現(xiàn)在終產(chǎn)品中的副產(chǎn)物。1、多糖降解降低黏度等另外某些多糖抗原可通過(guò)降解引入結(jié)合位點(diǎn)（如，末端羥基等）。通常采用物理（超聲、機(jī)械剪切）和化學(xué)（水解、氧化等）等方法進(jìn)行多糖降解。此外，部分活化、衍生工藝可能伴隨多糖及分布將影響結(jié)合物的免疫原性，降解過(guò)程中由于糖鏈的斷裂可能影響特異基團(tuán)的含量，因此應(yīng)提供多糖降解分子大小及分布范圍的擬定依據(jù)，以多糖降解物的分子大小及分布、抗原性等關(guān)鍵質(zhì)量屬性為考察指標(biāo)對(duì)降解工藝路線以及工藝參數(shù)進(jìn)行研究與優(yōu)化，開(kāi)展降解動(dòng)力學(xué)曲線研究。在工藝驗(yàn)證中對(duì)多糖分子大小及分布、特異基團(tuán)含量、抗原性等予以確認(rèn)，建議至少采用商業(yè)化規(guī)模工藝確認(rèn)批進(jìn)行降解動(dòng)力學(xué)曲線驗(yàn)證。2、活化、衍生活化和衍生工藝是指通過(guò)對(duì)多糖或蛋白質(zhì)分子的化學(xué)修飾，引入新的化學(xué)位點(diǎn)的過(guò)程?；罨?、衍生工藝路線較多且參與反應(yīng)的基團(tuán)和機(jī)理均不相同，應(yīng)基于多糖和蛋白的結(jié)構(gòu)和特性等選擇活化和/或衍生工藝，并進(jìn)行相應(yīng)的研究和驗(yàn)證。對(duì)于反應(yīng)速度較快、活性較高/易水解的化學(xué)反應(yīng)等，可考慮采用適宜處理方式（如低溫條件等）開(kāi)展動(dòng)力學(xué)曲線等工藝表征和驗(yàn)證，并鼓勵(lì)先進(jìn)分析方法（如NMR、GC-MS）的使用。工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)評(píng)估新化學(xué)位點(diǎn)的引入及其數(shù)量對(duì)抗原結(jié)構(gòu)和抗原性的影響，按照結(jié)合工藝需求擬定活化度、衍生率等關(guān)鍵質(zhì)量屬性范圍，據(jù)此研究確定化學(xué)反應(yīng)的抗原濃度、反應(yīng)溶液體系、活化化、衍生動(dòng)力學(xué)曲線研究，確認(rèn)工藝參數(shù)與活化度或衍生率的關(guān)系。對(duì)于多糖的化學(xué)修飾，還應(yīng)考慮化學(xué)反應(yīng)對(duì)特異基團(tuán)（如O-乙?；龋┖?、多糖分子大小和抗原性等的影響，制定參數(shù)范圍，采取有效的工藝控制策略。對(duì)于載體蛋白的化學(xué)修飾，應(yīng)考慮化學(xué)修飾過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)單體含量的影響，避免形成過(guò)度交聯(lián)。應(yīng)選擇有效的純化工藝去除工藝相關(guān)雜質(zhì)，包括活化試劑、有機(jī)溶劑、淬滅劑、未被結(jié)合的間隔劑以及相關(guān)試劑的副產(chǎn)物等，并對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中可能引入或產(chǎn)生的雜質(zhì)進(jìn)行全面評(píng)估驗(yàn)證以確定純化效果。對(duì)于活化、衍生工藝的驗(yàn)證，除放行檢測(cè)外，建議開(kāi)展化學(xué)反應(yīng)對(duì)多糖特異基團(tuán)（如O-乙酰基等）含量、多糖分子大小和抗原性等的影響驗(yàn)證；對(duì)蛋白單體含量、結(jié)合位點(diǎn)含量影響的驗(yàn)證，建議至少采用商業(yè)化規(guī)模工藝確認(rèn)批開(kāi)展活化、衍生動(dòng)力學(xué)曲線研究；進(jìn)行雜質(zhì)去除效果驗(yàn)證。3、結(jié)合工藝結(jié)合工藝系將多糖和載體蛋白進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合，應(yīng)提供結(jié)合工藝路線選擇依據(jù)及其反應(yīng)原理。工藝開(kāi)發(fā)應(yīng)對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進(jìn)行研究與確認(rèn)，包括多糖蛋白投料比及反應(yīng)濃度、反應(yīng)pH、溫度、反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)、終止反應(yīng)條件等。應(yīng)開(kāi)展結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線研究，關(guān)注活化和衍生基團(tuán)的利用并優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)以降低未反應(yīng)基團(tuán)比例。應(yīng)明確各純化工藝步驟目的，并對(duì)純化工藝的關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行研究與確認(rèn)，根據(jù)結(jié)合物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，對(duì)不同收集組分的多糖結(jié)合物進(jìn)行評(píng)估，合理地確定收集組分。結(jié)合反應(yīng)和純化工藝均應(yīng)建立相應(yīng)的過(guò)程控制策略，通過(guò)對(duì)反應(yīng)參數(shù)和純化參數(shù)的監(jiān)測(cè)和控制實(shí)現(xiàn)保證結(jié)合物質(zhì)量。多糖/蛋白比、結(jié)合物分子大小及分布、游離多糖、游離蛋白等關(guān)鍵質(zhì)量屬性，均對(duì)免疫原性產(chǎn)生影響，建議在工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中開(kāi)展可覆蓋工藝及產(chǎn)品質(zhì)量屬性變異范圍的動(dòng)物免疫原性研究，以確認(rèn)工結(jié)合及純化工藝驗(yàn)證除常規(guī)放行檢測(cè)項(xiàng)目外，應(yīng)對(duì)目標(biāo)分子大小的單價(jià)結(jié)合物的回收率，游離蛋白、游離多糖、未結(jié)合的活化位點(diǎn)和工藝相關(guān)雜質(zhì)的去除率等予以關(guān)注。建議至少采用商業(yè)化規(guī)模工藝確認(rèn)批開(kāi)展結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線驗(yàn)證，可通過(guò)游離蛋白/游離多糖-時(shí)間曲線進(jìn)行工藝可控性的驗(yàn)證。（五）制劑處方及生產(chǎn)工藝制劑中含有結(jié)合抗原、游離抗原、游離蛋白等多種組分，可能存在多種抗原、佐劑、緩沖液/輔料之間的相互作用。疫苗制劑可能需要通過(guò)抗原配制、緩沖液配制、佐劑配制、抗原-佐劑吸附、半成品配凍干等多步工藝實(shí)現(xiàn)。應(yīng)提供制劑處方、工藝及其確定依據(jù)，輔料來(lái)源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及檢驗(yàn)報(bào)告。表面活性劑等）、含量以及選擇的依據(jù)；可結(jié)合既往同類(lèi)品種研發(fā)情況、平臺(tái)知識(shí)，通過(guò)不同制劑處方/工藝對(duì)動(dòng)物藥效學(xué)研究（免疫原篩選和確定初步的制劑處方，提供相關(guān)依據(jù)。對(duì)于多價(jià)/多聯(lián)疫苗抗原含量，應(yīng)對(duì)不同血清型/抗原之間的相容性開(kāi)展研究，并建議對(duì)免疫原性潛在干擾予以關(guān)注。應(yīng)通過(guò)非臨床研究及早期臨床研究初步確定抗原含量，并在確證性臨床試驗(yàn)中予以驗(yàn)證。擬上市產(chǎn)品的制劑處方（包括配制點(diǎn)、規(guī)格等）應(yīng)與確證性臨床用樣品一致。制劑工藝開(kāi)發(fā)應(yīng)提供初步的研究資料（包括研究方法、研究結(jié)果和研究結(jié)論）以說(shuō)明關(guān)鍵工藝步驟及其參數(shù)控制范圍的合理性。半成品配制工藝，對(duì)原液和輔料的加入順序及加入量、混合攪拌的速度、時(shí)間和溫度控制等參數(shù)進(jìn)行研究與優(yōu)化。確保制劑過(guò)程中保持結(jié)合物的完整性和制劑的批間一致性。如為凍干制劑，應(yīng)對(duì)凍干工藝的關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進(jìn)行研究與優(yōu)化，提供凍干曲線；開(kāi)展凍干工藝對(duì)凍干前后結(jié)合疫苗質(zhì)量及相關(guān)特性、效力等影響的研究。如需添加佐劑，應(yīng)說(shuō)明添加佐劑的合理性及必要性，提供佐劑種類(lèi)、用量以及與抗原的最佳配伍劑量相關(guān)研究數(shù)據(jù)。使用佐劑所帶來(lái)的潛在獲益必須超過(guò)其所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)參照佐劑相關(guān)指導(dǎo)原則提交全套的佐劑藥學(xué)研究資料，如果佐劑與抗原相互吸附，應(yīng)提供吸附動(dòng)力學(xué)曲線，在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中開(kāi)展各個(gè)型別結(jié)合物吸附率的相關(guān)研究。根據(jù)多糖結(jié)合疫苗工藝研究及驗(yàn)證、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、穩(wěn)定性考察、臨床試驗(yàn)結(jié)果確定產(chǎn)品規(guī)格。多糖結(jié)合疫苗的產(chǎn)品規(guī)格原則上應(yīng)與配制五、質(zhì)量研究質(zhì)量研究需選擇代表性批次（如非臨床研究批次、臨床研究批次和（或）商業(yè)化工藝批次等）和/或適當(dāng)生產(chǎn)階段的樣品作為研究對(duì)象，除進(jìn)行常規(guī)放行檢驗(yàn)分析外，應(yīng)采用適宜分析方法進(jìn)行質(zhì)量特性分析研究，通常包括結(jié)構(gòu)特征、純度、雜質(zhì)分析（工藝相關(guān)雜質(zhì)及產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)）、生物學(xué)活性等研究，應(yīng)提供盡可能全面的信息以反映樣品的質(zhì)量屬性。鼓勵(lì)根據(jù)產(chǎn)品自身特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)更先進(jìn)的分析方法，同時(shí)應(yīng)關(guān)注樣品的處理和分析過(guò)程，避免預(yù)處理等分析過(guò)程對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生影響，導(dǎo)致分析結(jié)果無(wú)法代表樣品的實(shí)際質(zhì)量。（一）產(chǎn)品質(zhì)量特性研究1、不同階段中間產(chǎn)物糖鏈相關(guān)的質(zhì)量特性研究（精制多糖、降解產(chǎn)物、活化物、衍生物、結(jié)合物原液等）糖鏈的解析高度依賴(lài)于先驗(yàn)知識(shí)，如為已知多糖，可參考國(guó)內(nèi)外藥典、指導(dǎo)原則及相關(guān)文獻(xiàn)開(kāi)展研究；如為未知多糖，則需要進(jìn)行完精制多糖、降解產(chǎn)物、活化物、衍生物、結(jié)合物原液等的質(zhì)量特小及分布、糖鏈與載體蛋白的結(jié)合狀態(tài)（結(jié)合方式、比例、氨基酸利用率等）、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)和工藝相關(guān)雜質(zhì)殘留、安全性指標(biāo)（如細(xì)菌多糖降解物的質(zhì)量研究一般采用與精制多糖相同的方法，并關(guān)注相應(yīng)質(zhì)量屬性的變化情況。活化物、衍生物是經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的中間產(chǎn)物，應(yīng)根據(jù)活化、衍生基團(tuán)的物理化學(xué)特性選擇適宜的方法對(duì)修飾度予以表征。修飾度范圍應(yīng)通過(guò)理化指標(biāo)、生物學(xué)活性進(jìn)行確認(rèn)，避免對(duì)天然抗原的過(guò)度修飾?？刹捎枚炕虬攵康拿庖呋瘜W(xué)方法（如ELISA法、速率比濁法考察多糖抗原修飾前后的抗原活性變化情況,也可采用核磁共振的方法考察多糖抗原結(jié)構(gòu)是否存在變化。單價(jià)結(jié)合物原液質(zhì)量特性研究項(xiàng)目主要包括多糖/蛋白比、游離多糖、游離蛋白、分子大小及分布、糖鏈與載體蛋白的結(jié)合狀態(tài)、未反應(yīng)的活化基團(tuán)含量等。多糖/蛋白比、游離多糖、游離蛋白等既與結(jié)合物免疫原性相關(guān)，又是衡量批間一致性的重要指標(biāo)，應(yīng)采用適宜方法進(jìn)行檢測(cè)。多糖和蛋白質(zhì)形成結(jié)合物后，有些特異性化學(xué)基團(tuán)采用原有方法難以檢測(cè)，應(yīng)盡量采用其它適宜、可行的方法予以檢測(cè)。應(yīng)當(dāng)采用適宜方法證明單價(jià)結(jié)合物的多糖或載體蛋白上不含活化的功能基團(tuán)，或者通過(guò)檢測(cè)封閉反應(yīng)的產(chǎn)物或可監(jiān)測(cè)封閉反應(yīng)以顯示未發(fā)生反應(yīng)的功能基團(tuán)的殘留情況，對(duì)于可能存在的方法學(xué)局限應(yīng)進(jìn)行充分說(shuō)明。結(jié)合狀態(tài)系目前結(jié)合物解析的難點(diǎn)，可采用NMR、液質(zhì)聯(lián)用分析（LC-MS）、氨基酸分析等方法開(kāi)展研究。核磁共振技術(shù)可用于不同階段的中間產(chǎn)物（精制多糖、多糖降解包括單糖種類(lèi)、連接方式、修飾基團(tuán)等。部分多糖結(jié)合物樣品核磁解析存在技術(shù)難度，建議在臨床研究期間不斷完善相關(guān)檢測(cè)。通過(guò)對(duì)化學(xué)位移、積分、偶合常數(shù)信息的整合分析，完成對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)的完整解析。對(duì)于已知多糖，應(yīng)至少提供一維核磁圖譜，明確特征化學(xué)位移范圍及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)子或化學(xué)元素，鼓勵(lì)開(kāi)展二維核磁圖譜研究。定量核磁共振法整合了定量氫譜法和定量磷譜法，可高效進(jìn)行精制多糖和多糖降解物中多糖、磷、以及各特異基團(tuán)（糖醛酸、氨基己糖、甲基戊糖、O-乙?；?、甘油基團(tuán)和丙酮酸基團(tuán)等）含量的測(cè)定。應(yīng)根據(jù)多糖結(jié)構(gòu)和含量分析的目的，選用檢測(cè)性能足夠高的核磁共振儀，選擇適宜分析方法和樣品預(yù)處理方式進(jìn)行綜合解析；對(duì)于核磁共振圖譜解析過(guò)程應(yīng)建立綜合分析的手段。鼓勵(lì)采用高效液相色譜聯(lián)用多角度激光散射(HighPerformanceSizeExclusionChromatographyMultiangleLaserLightScattering,HPSEC-MALLS)、密度梯度離心等方法進(jìn)行精確分子量和分子大小及分布等研究。2、載體蛋白應(yīng)依據(jù)載體蛋白類(lèi)型、工藝路線開(kāi)展質(zhì)量特性研究，關(guān)注蛋白單體含量/均一性、結(jié)合位點(diǎn)含量等影響結(jié)合反應(yīng)的質(zhì)量特性。還應(yīng)對(duì)均一性、氨基含量等開(kāi)展研究。重組載體蛋白，除純度、單體含量、結(jié)合位點(diǎn)豐度外，應(yīng)按重組DNA蛋白制品要求開(kāi)展質(zhì)量研究，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)（氨基酸組成、游離巰基、翻譯后修飾、序列覆蓋率、質(zhì)體（單體、聚體、降解片段等）開(kāi)展研究。載體蛋白的純度高度依賴(lài)于檢測(cè)方法，應(yīng)選用對(duì)單體和聚體分離度較好的方法，并開(kāi)展對(duì)各峰組分歸屬解析等研究。部分工藝涉及衍生載體蛋白，應(yīng)對(duì)衍生率和衍生過(guò)程中對(duì)單體含量、純度及工藝相關(guān)雜質(zhì)殘留進(jìn)行研究，鼓勵(lì)采用肽指紋圖譜、氨基酸分析等適宜方法對(duì)蛋白質(zhì)衍生位點(diǎn)進(jìn)行分析。應(yīng)開(kāi)展制劑工藝對(duì)結(jié)合疫苗質(zhì)量特性、效力等影響的研究，包括制劑過(guò)程對(duì)結(jié)合物穩(wěn)定性影響的研究，如多糖結(jié)合物分子大小及分布、粒徑、游離糖含量變化等；如為多價(jià)疫苗或含佐劑疫苗，應(yīng)開(kāi)展全面的組分相容性研究，包括多個(gè)抗原、抗原-佐劑-緩沖體系之間的相容性等。對(duì)于含佐劑疫苗，建議在工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中開(kāi)展各個(gè)型別結(jié)合物的吸附狀態(tài)、吸附動(dòng)力學(xué)研究、吸附率等研究。（二）雜質(zhì)分析生產(chǎn)過(guò)程、貯存過(guò)程中產(chǎn)生的、和/或穩(wěn)定性研究批次中發(fā)現(xiàn)的潛在雜質(zhì)，包括工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。對(duì)于早期臨床試驗(yàn)申請(qǐng)，可根據(jù)來(lái)源、風(fēng)險(xiǎn)及殘留量的安全性水平等，列出潛在的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)（建議結(jié)合毒理試驗(yàn)結(jié)果、文獻(xiàn)資料、既往積累的科學(xué)認(rèn)知以及同類(lèi)產(chǎn)品的相關(guān)信息等綜合考慮）及工藝相關(guān)雜質(zhì)，對(duì)主要雜質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)與分析，必要時(shí)納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和/或進(jìn)行安全性初步評(píng)價(jià)。在上市申報(bào)前需進(jìn)一步進(jìn)行雜質(zhì)的分離、鑒別等分析研究。考慮其在生產(chǎn)和貯存期間是否顯著增加及其與疫苗有效性的相關(guān)性，參考ICHQ6B的理念評(píng)估其安全性風(fēng)險(xiǎn)，確定是否納入過(guò)程控制或放行標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)于需納入質(zhì)控體系的項(xiàng)目應(yīng)隨著研究的逐步推進(jìn)加強(qiáng)限度標(biāo)準(zhǔn)要求。對(duì)于《中華人民共和國(guó)藥典》收納的檢項(xiàng)，必須符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)是指生產(chǎn)或儲(chǔ)存過(guò)程中由目標(biāo)產(chǎn)物衍生的非預(yù)期未結(jié)合產(chǎn)物（游離多糖、游離蛋白等）等。對(duì)于C多糖等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)建議采用定量核磁共振法等適宜方法進(jìn)行測(cè)定。工藝相關(guān)雜質(zhì)是指生產(chǎn)過(guò)程中添加的非制劑組成部分的各種試劑殘留產(chǎn)生的雜質(zhì)，應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)用原材料、生產(chǎn)工藝等鑒定潛在的工藝相關(guān)雜質(zhì)，并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行定性和/或定量研究，評(píng)估雜質(zhì)殘留的安全性風(fēng)險(xiǎn)，必要時(shí)將具有潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)的雜質(zhì)殘留納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制?？紤]加入的反應(yīng)試劑多為有活性的試劑，部分試劑化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，應(yīng)依據(jù)試劑及副產(chǎn)物分子特性開(kāi)發(fā)適宜的檢測(cè)方法。對(duì)于與疫苗關(guān)鍵質(zhì)量屬性相關(guān)的工藝雜質(zhì)，如因產(chǎn)品特性無(wú)法在成品中檢測(cè)時(shí)，應(yīng)在適當(dāng)?shù)闹虚g產(chǎn)物（如精制多糖、結(jié)合物等）取樣檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果應(yīng)能準(zhǔn)確反映每一成品劑量中的殘留水平。（三）生物學(xué)活性生物學(xué)活性是反映產(chǎn)品質(zhì)量和臨床有效性的重要指標(biāo)，其通?？勺鳛楣に囬_(kāi)發(fā)階段工藝路線、關(guān)鍵工藝參數(shù)范圍及成品制劑處方的重要參考依據(jù)，同時(shí)也是穩(wěn)定性考察中的敏感指標(biāo)。體外抗原性檢測(cè)是工藝開(kāi)發(fā)、工藝確認(rèn)和工藝驗(yàn)證中的常用手段。鼓勵(lì)建立適宜的標(biāo)準(zhǔn)血清用于考察不同階段的中間產(chǎn)物其抗原性、總體抗原表位等在生產(chǎn)過(guò)程中保留的整體情況。體內(nèi)效力研究包括總抗體和功能性抗體的研究，建議進(jìn)行多糖含量、總抗體、功能抗體相關(guān)性研究，選擇適宜的效力方法進(jìn)行成品質(zhì)控。試驗(yàn)動(dòng)物的種屬及品系、免疫劑量、免疫程序和免疫途徑等因素均會(huì)對(duì)免疫應(yīng)答產(chǎn)生較大影響，因此在試驗(yàn)方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行充分考察及優(yōu)化。此外，隨著新技術(shù)的發(fā)展，可考慮采用糖芯片等技術(shù)進(jìn)行中間產(chǎn)物中糖鏈的免疫活性分析、利用單克隆抗體開(kāi)展糖抗原的抗原表位解析等研究。非特異性多糖、連接臂或生產(chǎn)過(guò)程中過(guò)度破壞的糖鏈等結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致非預(yù)期的免疫學(xué)反應(yīng)，鼓勵(lì)開(kāi)展相關(guān)研究。六、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立可參照《中華人民共和國(guó)藥典》、ICHQ6B和國(guó)內(nèi)外相關(guān)指導(dǎo)原則等，根據(jù)多糖結(jié)合疫苗產(chǎn)品特點(diǎn)、生產(chǎn)工藝、各階段質(zhì)量研究數(shù)據(jù)、批次放行檢測(cè)結(jié)果及穩(wěn)定性研究結(jié)果，結(jié)合非臨床研究和臨床研究批次綜合確定。對(duì)于一般工藝相關(guān)雜質(zhì)，如經(jīng)充分驗(yàn)證20/30證明生產(chǎn)工藝可對(duì)其有效、穩(wěn)定地清除，可結(jié)合工藝進(jìn)行控制，相關(guān)殘留物檢測(cè)可不列于放行檢測(cè)項(xiàng)目中。對(duì)于易受貯存過(guò)程影響、變化幅度較大且與產(chǎn)品安全、有效性相關(guān)的檢測(cè)項(xiàng)目，建議同時(shí)設(shè)置放行標(biāo)準(zhǔn)和貨架期標(biāo)準(zhǔn)。鼓勵(lì)采用先進(jìn)的理化分析方法進(jìn)行質(zhì)量控制，但應(yīng)提供方法的適用性驗(yàn)證等資料。通常先進(jìn)質(zhì)控方法在不同研發(fā)階段的方法適用性驗(yàn)證和不同實(shí)驗(yàn)室之間的方法轉(zhuǎn)移中存在較大挑戰(zhàn)，應(yīng)關(guān)注不同研發(fā)階段方法適用性驗(yàn)證的差異，并采用適宜方法對(duì)方法轉(zhuǎn)移前后檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)。申報(bào)臨床時(shí)可根據(jù)工藝確認(rèn)資料初步確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；上市階段應(yīng)按照相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)控制分析并基于工藝驗(yàn)證情況提供完整的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及方法學(xué)驗(yàn)證資料。建議考慮以下質(zhì)控項(xiàng)目：固體總量、鑒別試驗(yàn)、多糖含量、特異基團(tuán)含量、分子大小及分布、核酸殘留量、蛋白質(zhì)殘留量、其他工藝雜質(zhì)殘留、細(xì)菌內(nèi)毒素、無(wú)菌等檢測(cè)。采用凍干保存的精制多糖，應(yīng)對(duì)水分殘留量進(jìn)行質(zhì)控。對(duì)于特異基團(tuán)，應(yīng)提供檢測(cè)基團(tuán)選擇的依據(jù)。（二）多糖降解物考慮降解多糖分子大小與后續(xù)生產(chǎn)工藝及結(jié)合物免疫原性密切相關(guān)，應(yīng)對(duì)多糖降解物分子大小及分布進(jìn)行質(zhì)量控制。如在工藝開(kāi)發(fā)和質(zhì)量特性研究中證明多糖降解工藝對(duì)特異基團(tuán)含量有影響，則需對(duì)特異基團(tuán)含量進(jìn)行質(zhì)量控制。（三）多糖活化物、衍生物應(yīng)采用適宜的方法檢測(cè)化學(xué)修飾的效果,即活化度或衍生率；另外，可采用凝膠過(guò)濾或高效液相色譜等適宜方法測(cè)定活化物、衍生物21/30的分子大小及分布，以確保多糖－蛋白結(jié)合反應(yīng)的批間一致性。（四）載體蛋白若采用已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的破傷風(fēng)類(lèi)毒素和白喉類(lèi)毒素等作為載體，應(yīng)采用高效液相色譜等方法進(jìn)行單體含量質(zhì)控；采用適宜方法進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)含量（如，氨基含量）檢測(cè)。方法學(xué)驗(yàn)證中應(yīng)關(guān)注所選用方法是否可有效分離載體蛋白單體、聚體，同時(shí)建議進(jìn)行各采用上述以外的其它蛋白作為載體，除參照上述載體蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求外，結(jié)合其自身特點(diǎn)及生產(chǎn)工藝建立相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，比如純度、蛋白含量、細(xì)菌內(nèi)毒素、宿主DNA殘留、活性/特異性毒性（如適用）等。以重組蛋白為載體的，同時(shí)應(yīng)參照重組DNA蛋白制品相關(guān)要求進(jìn)行質(zhì)量控制，建議采用兩種不同原理的檢測(cè)方法對(duì)純度進(jìn)行質(zhì)結(jié)合前，對(duì)載體蛋白進(jìn)行衍生處理的，應(yīng)進(jìn)行衍生率、純度（如單體含量、分子大小及分布等）質(zhì)控，以確保批間一致性。（五）單價(jià)結(jié)合物原液不同多糖結(jié)合疫苗可能采用不同的結(jié)合工藝，但均需進(jìn)行多步反應(yīng)。為了確保結(jié)合物的穩(wěn)定性、安全性、有效性和批間一致性，應(yīng)建立相應(yīng)的質(zhì)量控制方法。建議考慮以下質(zhì)控項(xiàng)目：1、鑒別：采用適當(dāng)方法進(jìn)行多糖和載體蛋白的鑒別試驗(yàn)。2、含量檢測(cè)：包括多糖含量、蛋白質(zhì)含量等。3、多糖/蛋白比：該指標(biāo)對(duì)結(jié)合物的免疫原性、一致性、穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，可作為判斷結(jié)合反應(yīng)的一個(gè)間接標(biāo)志。如果化學(xué)結(jié)合反應(yīng)過(guò)程能產(chǎn)生獨(dú)特的結(jié)合標(biāo)志（例如某一獨(dú)特的氨基酸可通過(guò)測(cè)定22/30該標(biāo)志物定量分析多糖—蛋白結(jié)合反應(yīng)的程度。4、分子大小及分布：檢測(cè)方法包括已收錄《中華人民共和國(guó)藥典》的SepharoseCL-4B/CL-2B，鼓勵(lì)采用先進(jìn)的方法進(jìn)行分子大小及分布的放行檢測(cè)。5、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)：包括但不限于游離多糖、游離蛋白含量等，游離多糖測(cè)定應(yīng)設(shè)立試驗(yàn)成功的條件，如每次沉淀游離多糖的回收率要求等。游離蛋白檢測(cè)方法包括SDS電泳、HPLC等方法。6、工藝相關(guān)雜質(zhì)：應(yīng)結(jié)合雜質(zhì)殘留的安全風(fēng)險(xiǎn)、工藝路線和去除效果進(jìn)行綜合考慮，將具有潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)的雜質(zhì)殘留納入質(zhì)量標(biāo)7、安全性指標(biāo)：包括無(wú)菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。對(duì)于含佐劑的多價(jià)疫苗，如采用先添加佐劑（如，吸附等）后混合工藝，則應(yīng)對(duì)吸附后單價(jià)原液的多糖含量、游離多糖含量、佐劑含量、吸附率和無(wú)菌等進(jìn)行檢測(cè)。（六）半成品在充分的質(zhì)量研究和工藝驗(yàn)證的前提下，半成品應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌檢查。（七）成品（不含多聯(lián)疫苗）建議考慮以下質(zhì)控項(xiàng)目：產(chǎn)品鑒別、理化特性、含量、安全性指標(biāo)、生物學(xué)活性等。凍干劑型，應(yīng)對(duì)復(fù)溶用稀釋劑進(jìn)行檢測(cè)。多聯(lián)疫苗應(yīng)參照相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行檢查。1、鑒別：通常采用多糖和載體蛋白的特異性抗體進(jìn)行免疫學(xué)測(cè)2、理化特性：包括外觀、pH值、裝量、滲透壓摩爾濃度、分子大小及分布等。如為凍干制品，應(yīng)進(jìn)行水分質(zhì)控。23/30量（如必要）等。如使用佐劑，應(yīng)進(jìn)行佐劑含量、吸附率、結(jié)合抗原含量、結(jié)合蛋白含量等質(zhì)控。4、安全性指標(biāo)：通常包括內(nèi)毒素、異常毒性、無(wú)菌檢查等。5、生物學(xué)活性檢測(cè)：由于動(dòng)物體內(nèi)免疫原性檢測(cè)方法存在較大變異性，建議設(shè)立參考疫苗以適宜的比值方法擬定標(biāo)準(zhǔn)限度。不同多糖蛋白結(jié)合疫苗對(duì)試驗(yàn)用動(dòng)物的敏感性不同，建議結(jié)合先驗(yàn)知識(shí)、藥效學(xué)研究等，合理選擇試驗(yàn)用動(dòng)物、免疫程序及免疫劑量等。（八）分析方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)多糖結(jié)合疫苗的產(chǎn)品特點(diǎn)和工藝特點(diǎn)選擇合理的分析方法。成品存在型別多、糖含量低的品種，可分別或組合使用理化、免疫學(xué)方法進(jìn)行全面質(zhì)控。原液和成品檢測(cè)均涉及進(jìn)行樣品的預(yù)處理，如游離多糖沉淀、佐劑解吸附、多糖水解為特異單糖等，預(yù)處理過(guò)程可能引入系統(tǒng)誤差，原則上，應(yīng)確保預(yù)處理過(guò)程可保持產(chǎn)品的固有狀態(tài)或反映產(chǎn)品的原始狀態(tài)，獲得可接受的回收率，必要時(shí)應(yīng)建立試驗(yàn)成立的內(nèi)控。鼓勵(lì)采用先進(jìn)方法進(jìn)行質(zhì)控，如，采用NMR等方法對(duì)多糖鑒別、特異基團(tuán)和雜質(zhì)等進(jìn)行質(zhì)量控制；采用HPLC等方法對(duì)工藝相關(guān)雜質(zhì)殘留進(jìn)行檢測(cè)；采用HPSEC-MALLS等進(jìn)行分子量大小及分布的質(zhì)控。對(duì)于《中華人民共和國(guó)藥典》方法，應(yīng)評(píng)估后進(jìn)行適用性確認(rèn)。自建方法應(yīng)經(jīng)全面驗(yàn)證后根據(jù)方法檢測(cè)目的物質(zhì)的不同，確認(rèn)并驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度、精密度（包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專(zhuān)屬性、檢測(cè)限、定量限、線性、范圍和耐用性等指標(biāo)。申報(bào)臨床時(shí)提供的方法學(xué)驗(yàn)證資料應(yīng)能初步證實(shí)檢測(cè)方法的適用性，分析方法的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證應(yīng)隨著產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和研究的不斷深入逐步優(yōu)化完善并驗(yàn)證；上市階段應(yīng)按照相關(guān)指導(dǎo)原則提供全面的方法學(xué)24/30驗(yàn)證資料。研發(fā)期間若發(fā)生方法學(xué)變更或轉(zhuǎn)移，應(yīng)開(kāi)展相應(yīng)的檢測(cè)方1、分子大小及分布應(yīng)基于產(chǎn)品特性及生產(chǎn)工藝采用適宜方法客觀反映分子量大小及分布情況，所用方法應(yīng)在適當(dāng)?shù)姆肿恿糠秶鷥?nèi)具有足夠的分離度。由于不同工藝階段的產(chǎn)物（多糖、水解多糖、活化多糖、某些載體蛋白、結(jié)合物等）均具有分子量連續(xù)分布等特點(diǎn)，對(duì)于分子量大小及其分布的檢測(cè)，應(yīng)關(guān)注方法分離范圍與待檢產(chǎn)品的適用性及產(chǎn)品分離度基于KD值及其回收率表征分子大小及分布的方法，應(yīng)選擇能較敏感地反映產(chǎn)品批間一致性的KD界值，同時(shí)推薦對(duì)50%峰面積對(duì)應(yīng)的KD值進(jìn)行相關(guān)研究并積累數(shù)據(jù)?；贖PSEC-MALLS測(cè)定重均分子量的檢測(cè)方法，需要關(guān)注多糖結(jié)構(gòu)、純度對(duì)dn/dc的影響，開(kāi)展本方法與《中華人民共和國(guó)藥典》方法的相關(guān)性研究。多價(jià)疫苗成品因單價(jià)結(jié)合物抗原無(wú)法分離且含量低，可采用總抗原分子大小檢測(cè)方法，以反映總抗原的穩(wěn)定性。如有必要，應(yīng)該開(kāi)發(fā)單價(jià)原液特異性的分子大小檢測(cè)方法。2、多糖含量檢測(cè)通常包括化學(xué)方法、色譜法和免疫學(xué)方法的檢測(cè)，應(yīng)關(guān)注以下方面1）化學(xué)方法和色譜法（如HPAEC-PAD多用于價(jià)次較少的結(jié)合疫苗，采用多糖特異基團(tuán)含量進(jìn)行計(jì)算，需關(guān)注各種抗原中特異性單糖或化學(xué)基團(tuán)的水解及洗脫、對(duì)照品的選擇；明確對(duì)應(yīng)型別的計(jì)算包括ELISA、火箭電泳、速率比濁法等。（3）單價(jià)結(jié)合物原液一般采25/30用化學(xué)法檢測(cè)多糖含量，多價(jià)多糖結(jié)合疫苗成品常采用免疫法進(jìn)行多糖含量檢測(cè)，考慮兩種方法多糖含量檢測(cè)結(jié)果存在系統(tǒng)差異，建議在前期研發(fā)中對(duì)兩種方法的相關(guān)性進(jìn)行充分研究及數(shù)據(jù)積累，避免因檢測(cè)方法導(dǎo)致擬上市產(chǎn)品與確證性臨床批次配制點(diǎn)存在差異。（4）成品抗原含量相關(guān)檢測(cè)方法，易受凍干保護(hù)劑、佐劑和表通常需要分離抗原后檢測(cè)，需進(jìn)行解吸附等預(yù)處理效果等驗(yàn)證。3、游離糖含量檢測(cè)結(jié)合物原液多采用脫氧膽酸鈉法、高鹽高醇析出法、氫氧化鋁凝膠結(jié)合法對(duì)游離多糖和結(jié)合多糖進(jìn)行分離；多價(jià)產(chǎn)品因含量低、佐劑和組分干擾等因素，部分產(chǎn)品原液游離多糖方法在成品檢測(cè)時(shí)不適用。凍干疫苗可采用減少?gòu)?fù)溶體積的方式實(shí)現(xiàn)成品含量的富集，用以檢測(cè)游離多糖和游離蛋白。抗原含量低的多價(jià)液體/佐劑吸附疫苗，游離多糖和游離蛋白檢測(cè)方法需滿足相應(yīng)的定量限或檢出限要求。應(yīng)關(guān)注不同預(yù)處理方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，建議對(duì)方法成立條件進(jìn)行控制；通過(guò)加標(biāo)試驗(yàn)等方法學(xué)驗(yàn)證證實(shí)方法學(xué)的適用性，驗(yàn)證時(shí)應(yīng)采用與殘留水平一致的樣品進(jìn)行摻入。4、結(jié)合抗原含量/結(jié)合蛋白含量（boundantigen/boundprotein）用以表征總吸附率和總結(jié)合率，應(yīng)驗(yàn)證吸附成分和非吸附成分的分離效果，采用上清或沉淀含量的測(cè)定方法均可接受，如檢測(cè)方法與總抗原或蛋白檢測(cè)方法有差異，應(yīng)證明方法差異不影響檢測(cè)結(jié)果。5、殘留量檢測(cè)鼓勵(lì)采用色譜法等更為敏感的方法進(jìn)行相關(guān)殘留的研究。準(zhǔn)確度驗(yàn)證中應(yīng)添加可覆蓋產(chǎn)品實(shí)際濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)行驗(yàn)證。6、檢測(cè)用血清檢測(cè)用血清用于產(chǎn)品工藝開(kāi)發(fā)、質(zhì)控方法開(kāi)發(fā)，是影響產(chǎn)品成功26/30開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵因素之一，需要關(guān)注其對(duì)多糖抗原表位保留能力的表征、特異性、效價(jià)、批間一致性、儲(chǔ)備量和保存穩(wěn)定性。應(yīng)盡可能采用質(zhì)量較高的抗原進(jìn)行血清的制備。多價(jià)疫苗血清易發(fā)生抗原與血清的交叉反應(yīng)，可采取適當(dāng)?shù)募兓蚪徊嫖揭詼p少交叉反應(yīng)，保證特異性。應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清效價(jià)（或特異性抗體含量）進(jìn)行質(zhì)量控制，低效價(jià)血清往往無(wú)法滿足多價(jià)疫苗抗原定量檢測(cè)的要求。申請(qǐng)人應(yīng)建立及儲(chǔ)備較充足的檢測(cè)用血清，同時(shí)采用適宜的保存條件，以保證其在效期內(nèi)滿足檢測(cè)要求。（九）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的建立和制備可參照《中華人民共和國(guó)藥典》和其它相關(guān)指導(dǎo)原則要求。若采用國(guó)際/國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，應(yīng)明確所用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息（來(lái)源、批次、檢定等）。若為自制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，應(yīng)進(jìn)行制備工藝、標(biāo)定、穩(wěn)定性等相關(guān)研究。建議采用確證性臨床試驗(yàn)批次建立關(guān)鍵質(zhì)量屬性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的可溯源性。由于存在多個(gè)中間產(chǎn)物、多種檢測(cè)方法，多糖結(jié)合疫苗檢測(cè)涉及到多種種類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。以單一成分存在的中間產(chǎn)物或成品，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可選擇相應(yīng)的單一成分或特性相似的物質(zhì)。多價(jià)疫苗成品多糖抗原含量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用化學(xué)法檢測(cè)的，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)與抗原有相同的化學(xué)反應(yīng)特性，如采用離子色譜法測(cè)定多糖含量時(shí)，當(dāng)結(jié)合物中的多糖可被完全水解為單糖，則以單糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，當(dāng)結(jié)合物中的多糖不可被完全水解為單糖，則考慮以多糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。采用免疫學(xué)檢測(cè)方法的，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)保持穩(wěn)定的抗原性，以保證其參與抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的穩(wěn)定性。以含多糖的抗原作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)抗原含量進(jìn)行賦值。應(yīng)選