T-CVMA 173-2024 豬偽狂犬病病毒gB蛋白磁微粒化學發(fā)光抗體檢測方法

T/CVMA173—2024豬偽狂犬病病毒gB蛋白磁微?；瘜W發(fā)光抗體檢測方法MagneticparticlechemiluminescentimmunoassaydetectionofgBantibodiesagainstpseudorabiesvirus2024-7-4發(fā)布2024-7-4實施中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I本文件由洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司病預防控制中心、河南科技大學、洛陽萊普生信息科技有12規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范CLIA：化學發(fā)光免疫分析（ChemiluminePRV:豬偽狂犬病毒（PseudorabiesVirus）RLU：相對光單位發(fā)光值（RelativeLightUnit）carbodiimidehydrochlori2本文件采用磁微?；瘜W發(fā)光——競爭法原理，用豬偽狂犬病毒gB重組蛋白包被磁微粒，酶標單克抗原-待測抗體復合物；抗原-酶標抗體復合物催化發(fā)光底物液發(fā)出光子形成發(fā)光值（RLU其發(fā)光強度與豬偽狂犬病毒gB抗體的含量成反比。根據(jù)樣本發(fā)光值與陰性對照發(fā)光值的比值，判斷豬偽狂犬病毒gB抗體水平，比值越大，說明樣本中豬偽狂犬病毒gB抗體水平越低；比值越小，說明樣本中豬偽狂6.1包被磁微?；鞈乙?，按照附錄A制6.2酶標單克隆抗體（辣根過氧化物酶標記的豬偽狂按照NY/T541中規(guī)定進行樣本的采集與處理，期間做好個人防護。按常規(guī)方法抽取2mL～3mL血按照NY/T541中規(guī)定進行血清樣本的存放與運輸。血清樣本若在一周內(nèi)檢測，置2℃~8℃條件下保存。若超過一周檢測，置于-20℃以下冷凍保存。運將待檢樣品從2℃~8℃或-20℃冰箱取出，靜置至室溫。3參照磁微粒化學發(fā)光儀器系統(tǒng)操作說明，按b）加磁微粒混懸液。每孔分別加入磁微粒混懸液20μL。c）孵育?；靹蚝?7℃溫育30min。d）洗滌。使用磁鐵吸附磁微粒10s，使其聚集于孔壁，棄去上清液。加入洗滌液30f）讀值。檢測完成后，儀器自動計算并讀取數(shù)據(jù)結(jié)果，打印報告。如本次檢測完畢則清空廢液、9試驗成立條件S/N≤0.5，為豬偽狂犬病病毒gB抗體陽性；S/N＞0.5，為豬偽狂犬病病毒gB抗體陰性。4取1mL磁微粒原液進行磁分離至上清澄清，棄去上清；移液器移取1mL加入1mL4mg/mLEDC溶液，蓋緊瓶蓋/容器封口，室溫條件下活化反應(yīng)60min。A.2洗滌A.3包被豬偽狂犬病毒重組蛋白gB包被抗原。蓋緊瓶蓋/容器封器，2℃~8℃條件下反應(yīng)120min。A.4封閉將反應(yīng)容器進行磁分離至上清澄清，棄去上清；移液器精確移取4mL磁微粒洗滌液加入反應(yīng)容器液加入反應(yīng)容器內(nèi)；以100r/min混合15min，最終進行磁分離至上清澄清，棄去上清。A.5制備后儲存準確量取磁微粒保存液100mL，以100r/min混5稱取24.23gTris（三羥甲基氨基甲烷）溶于800mL純水中，充分攪6用豬偽狂犬病滅活疫苗免疫豬偽狂犬病gB抗體陰性健康豬，耳根后肌肉注射，首次免疫28日后進的0.04%加入Proclin-300防腐，經(jīng)0.22μm濾器過濾除菌，無菌分裝，作為陽性對照，置2℃~8℃保存挑選豬偽狂犬病gB抗體陰性健康豬，經(jīng)前腔靜脈大量采血分離血活30min后，