大腸桿菌感受態(tài)細胞的置備與質粒轉化課件_第1頁
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文檔簡介

大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉化

二.實驗原理感受態(tài)細胞(Competentcells):受體細胞經過一些特殊方法處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能使許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細胞(competentcell)。

大腸桿菌轉化的方法：化學法：使用化學試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導入受體細胞；電轉化法：通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。轉化子的篩選：利用導入的DNA上的選擇性標記，區(qū)分轉化子與非轉化子。選擇性標記主要有兩類： 營養(yǎng)篩選標記 抗性篩選標記三．實驗方法

1．挑取大腸桿菌DH5α單菌落，接于5mLLB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜2．以1:50比例將1ml菌液轉移到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)1.5－2hr左右，使A600在0.4－0.5左右3．將培養(yǎng)液4ml轉移到5ml離心管中，4℃，2000g離心3min4．棄上清，加0.5mL用冰預冷的0.1MCaCl2溶液，輕輕吹打或搖動混勻細胞注意：加入CaCl2動作需輕柔，勿劇烈震蕩，并且盡量使細胞處于低溫中5．冰上放置20min，2000g離心2min

6．棄上清，加0.1ml預冷的0.1MCaCl2溶液，輕輕吹打或搖動混勻細胞，即得感受態(tài)細胞注意：離心后觀察沉淀，如果出現中間空心的沉淀說明操作正常7．將取0.1ml感受態(tài)細胞轉移到1.5ml離心管中，加2μl質粒，混勻，冰上放置30min8．42℃水浴90秒,在冰上放置2min9．加入0.5ml新鮮LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm振蕩約30min－45min（注：轉純質?？墒÷?，轉連接產物需進行）10.取100μl涂布到含有氨芐青霉素的平板上,加X-gal/IPTG各3μL

11．倒置平皿，37℃培養(yǎng)12~16h每個平板大約20ml的培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基用CaCl2法制備的感受態(tài)細胞，可使每微克超螺旋質粒DNA產生5106-2

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