DB51T 1298-2011 山羊傳染性胸膜肺炎診斷技術(shù)規(guī)范　

備案號：30901-2011DB51/T1298—2011山羊傳染性胸膜肺炎診斷技術(shù)規(guī)范四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB51/T1298—2011 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語與定義 14臨床癥狀與剖檢變化 15病原分離與鑒定 2附錄A(資料性附錄)培養(yǎng)基 6附錄B(資料性附錄)試劑配制 7本標(biāo)準(zhǔn)由四川省畜牧食品局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：西南民族大學(xué)四川省畜禽繁殖改良總站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊發(fā)龍岳華王永湯承傅昌秀。11范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了山羊傳染性胸膜肺炎的病原分離培養(yǎng)及山羊支原體山羊肺炎亞種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于山羊傳染性胸膜肺炎的診斷，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)適用于山羊支原體山羊肺炎亞種的檢測與鑒定。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。山羊傳染性胸膜肺炎ContagiousCaprinePleuropneumonia是由山羊支原體山羊肺炎亞種感染山羊而引起的一種以呼吸道癥狀為主要特征的傳染病。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasecha是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于體外大量擴(kuò)增特定的DNA片段。是人工合成的兩段寡核苷酸序列，用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中一條引物與目標(biāo)片段一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一條引物與目標(biāo)片段另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。4臨床癥狀與剖檢變化該病的典型臨床癥狀表現(xiàn)為極度高熱(41℃-43℃),隨后2d-3d出現(xiàn)明顯的呼吸道癥狀，表現(xiàn)為呼吸加速、顯得痛苦、有時發(fā)現(xiàn)呼嚕聲，出現(xiàn)持續(xù)性的劇烈咳嗽。在疾病后期病羊不能運(yùn)動、兩前肢分開站立、脖子僵硬前伸，有時嘴里不斷流出涎液。本病的病變多局限于胸腔內(nèi)。多在一側(cè)肺臟發(fā)生嚴(yán)重的浸潤和明顯的肝變，其肝變區(qū)凸出肺表面，顏色由紅至灰不等。病肺質(zhì)硬而沒有彈性，切面呈大理石狀。纖維蛋白滲出液充盈使肺小葉間組織變寬，2用無菌技術(shù)，采集肺組織(病健交界處最好)、胸腔滲出液及縱隔淋巴結(jié)。采集的病料在低溫條件下盡快(24h內(nèi))送到實(shí)驗室進(jìn)行檢測，如果檢測不能及時進(jìn)行，應(yīng)保存在5.2.2.1鼻拭子3呈輕微混濁，無菌膜、無沉淀、無顆粒懸浮。在瓊脂平板上生長遲緩，形成極小的水滴狀圓形、透明菌落，需用放大鏡或低倍顯微鏡進(jìn)行觀察。菌落中央有乳頭狀突起，呈“煎蛋狀”。5.2.4.2染色鏡檢取液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)基上菌落涂片，姬姆薩氏染色法染色，1000倍顯微鏡下觀察。菌體多呈球5.3.1主要設(shè)備5.3.1.5微量高速離心機(jī)(適合于對PCR反應(yīng)管進(jìn)行離心操作)5.3.1.6高壓滅菌鍋5.3.1.7恒溫水浴鍋5.3.2主要試劑5.3.2.1引物(10μmol/L)5.3.2.2DNA提取試劑蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉(SDS)、酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇。TaqDNA聚合酶(5U/μL)、MgCl?(25mmol/L)、dNTP(每種濃度為2.5mmol/L)、10×PCRBuffer(無5.3.2.4STE緩沖液(組成及配制方法見附錄B)5.3.2.7瓊脂糖(電泳級)5.3.2.10水所用水應(yīng)符合GB/T6682中三級水(三蒸水)規(guī)格。45.3.3DNA提取組織樣本：肺等組織樣本，按1g加入1mL的STE,進(jìn)行研磨，3000r/min進(jìn)行離心10min,取上清液，12000r/min進(jìn)行離心20min,棄上清，沉淀用棉拭子：將鼻腔拭子等棉拭子浸入1mL的STE緩沖液中30min,反復(fù)擠壓，然后以12000r/min離心20min,棄去上清，收集沉淀用于DNA提取。液體培養(yǎng)物：12000r/min離心20min,棄上清，收集沉淀用于DNA提取。5.3.3.2DNA提取方法混勻，在56℃水浴60min。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),混勻，12000r/min離心5min。轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1),顛倒混勻，12000r/min離心5min。取上清，加入2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，-20℃沉淀30min,12000r/min離心5min,棄去上清液。用1mL70%℃保存?zhèn)溆谩?.3.4PCR擴(kuò)增每次對檢測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，均需要設(shè)置陽性和空白對照。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min,然后進(jìn)行95℃1min,48℃1min,72℃30s的循環(huán)，進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸10min,4℃保存。5.3.5PCR產(chǎn)物的電泳檢測用TAE電泳緩沖液配制成2%瓊脂糖凝膠(見附錄B)。取5μLPCR產(chǎn)物與1μL6×上樣緩沖液混合，分別加入樣品孔，同時在一加樣孔中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，以5V/cm恒壓電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。陽性對照出現(xiàn)一條316bp左右大小的條帶，且無模板空白對照不出現(xiàn)條帶，見圖1。在滿足上述條件的情況下，被檢樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)一條316bp左右的條帶判定為陽性(+);被檢樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后不出現(xiàn)316bp左右的條帶判定為陰性(一)。5DB51/T1298—2011400bp200bpM——DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P——陽性對照；N——陰性對照。6(資料性附錄)A.1改良Thiaucourt's培養(yǎng)基A.1.1組成PPLO肉湯650mL;健康馬血清250mL;25%酵母浸出液100mL;50%葡萄糖溶液4mL;25%丙酮酸鈉溶液8mL;1%醋酸鉈溶液25mL;青霉素20萬單位；0.4%酚紅溶液5mL;A.1.2制備方法制備時，將PPLO肉湯進(jìn)行121℃30min高壓蒸汽滅菌，其他成分濾過除菌，待PPLO肉湯降溫至55℃-60℃時，其他成分與其混合，用滅菌的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.6-7.8.制備固體培養(yǎng)基時，在PPLO肉湯中加入培養(yǎng)基總體積1.5%的瓊脂，加熱溶解后121℃30min高壓蒸汽滅菌，待溫度降至55℃-60℃時與其他成分混合，固體培養(yǎng)基中不含酚紅。7(資料性附錄)試劑配制B.1STE緩沖液0.1mol/LNaC110mmol/LTris.HC1(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)B.2TAE電泳緩沖液(pH8.0)50×TAE電泳緩沖液貯存液：Tris堿242gEDTA37.