《類器官在化學(xué)品毒性測試中的應(yīng)用技術(shù)規(guī)范（征求意見稿）》

ICSCCS點擊此處添加CCS號32范（本草案完成時間：2024.06.01）在提交反饋意見時，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。IDBXX/TXXXX—XXXX 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4實驗原理 5試劑和耗材 6儀器設(shè)備 27試驗方法 2附錄A（資料性）類器官生長速率檢測 6附錄B（資料性）類器官標(biāo)志物表達(dá)水平檢測 7DBXX/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。為指導(dǎo)開展類器官（腦、心、肺、腸、肝）在化學(xué)品毒性測試中的應(yīng)用，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。本文件由南京醫(yī)科大學(xué)提出。本文件由江蘇省衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：南京醫(yī)科大學(xué)、同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院、東南大學(xué)、生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所、蘇州疾病預(yù)防控制中心、南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院。本文件主要起草人：顧愛華、徐進(jìn)、劉倩、蔣兆彥、楊楊、張娟、吉貴祥、邵文濤、趙鵬、胡佳、金經(jīng)、郭文慧、顧杰。DBXX/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件主要描述了類器官在化學(xué)品毒性測試中的應(yīng)用技術(shù)規(guī)范，包括腦、心、肺、腸、肝類器官的構(gòu)建和毒性評價方法。1DBXX/TXXXX—XXXX類器官在化學(xué)品毒性測試中的應(yīng)用技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了類器官（腦、心、肺、腸、肝）在化學(xué)品毒性測試中的應(yīng)用技術(shù)規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)適用于開展各類化學(xué)品對相應(yīng)組織器官來源的類器官的毒性測試。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1類器官organoid由干細(xì)胞或前體細(xì)胞體外培養(yǎng)形成，由組織器官特異性的多種細(xì)胞組成，具有特定組織器官關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能特性的三維細(xì)胞培養(yǎng)物。3.2毒性測試toxicitytesting給受試物進(jìn)行不同途徑、不同時間的染毒，檢測各種毒性終點的實驗。4實驗原理通過構(gòu)建腦、心、肺、腸、肝類器官，檢測化學(xué)品處理下，類器官各指標(biāo)的變化情況，以反映化學(xué)品相應(yīng)靶器官毒性大小。5試劑和耗材5.1試驗中所用的試劑，在沒有注明其他要求時，均指分析純試劑；所使用的水，在未說明規(guī)格時，應(yīng)符合GB/T6682中純水的規(guī)定。5.2試劑和耗材宜包括但不限于：a)DMEM/F12培養(yǎng)基、PGM1多能干細(xì)胞培養(yǎng)基、Essential6?培養(yǎng)基、Neurobasal?-A培養(yǎng)基、小鼠肺類器官培養(yǎng)基、小鼠腸類器官培養(yǎng)基、小鼠肝類器官培養(yǎng)基、TeSR?E8?培養(yǎng)基、B27培養(yǎng)基；b)Matrigel基質(zhì)膠；c)Accutase消化液、EDTA溶液；2DBXX/TXXXX—XXXXd)胎牛血清（FBS）；e)細(xì)胞篩（30μm、70μm、100μm）；f)青霉素、鏈霉素、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、B-27添加劑（不含維生素A）、成纖維細(xì)胞生長因子2（FibroblastGrowthFactor2，F(xiàn)GF2）、激活素A（ActivinA）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）、6-[[2-[[4-（2，4-二氯苯基）-5-（5-甲中性蛋白酶（Dispase）、IV型膠原酶、ROCK抑制劑（Y-27632）、肝素、成纖維細(xì)胞生長因子9（FGF9）、4-[4-（1,3-苯并二氧雜環(huán)戊醇-5-基）-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺（SB431542）、dorsomorphin、XAV-939、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（GlutaMAX）、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）、Wnt-C59；g)磷酸鹽緩沖液（PBS）、紅細(xì)胞裂解液、DNA酶溶液；h)T25培養(yǎng)瓶（poly-HEMA包被）、Elplasia96孔板、低粘附孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿、transwell小室。6儀器設(shè)備儀器設(shè)備至少應(yīng)包括：a)生物安全柜；b)激光共聚焦顯微鏡；c)離心機；d)細(xì)胞培養(yǎng)箱；e)低速圓周搖床；f)倒置顯微鏡；g)移液槍；h)無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿；i)多功能酶標(biāo)儀；j)醫(yī)用冰箱。7試驗方法7.1類器官構(gòu)建7.1.1腦類器官構(gòu)建7.1.1.1腦類器官宜采用人胚胎干細(xì)胞H9構(gòu)建，培養(yǎng)于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中，通過定向分化為背側(cè)前腦類器官。7.1.1.2當(dāng)H9干細(xì)胞生長匯合度約80%~90%后，用0.5mMEDTA溶液消化為單細(xì)胞，用含有10μMY27632的PGM1多能干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸。將300μL共含有75萬個細(xì)胞的懸液轉(zhuǎn)移至Elplasia96孔板中（Elplasia96孔板需提前加入含有10μMY27632的PGM1多能干細(xì)胞培養(yǎng)基以500g×3min進(jìn)行離心浸潤，排除微孔底部的空氣）。7.1.1.3將孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6~12h后，觀察到干細(xì)胞形成邊緣光滑的球體后，轉(zhuǎn)移到低粘附的6孔板中。7.1.1.4Day0~6背側(cè)前腦類器官形成：將培養(yǎng)基替換為預(yù)熱的Essential6?培養(yǎng)基（10μMSB431542、2.5μMdorsomorphin、2.5μMXAV-939、1%青霉素/鏈霉素），每孔2mL液體，前兩天維持穩(wěn)定不更換培養(yǎng)基，后面每天換液。3DBXX/TXXXX—XXXX7.1.1.5D6~25背側(cè)前腦類器官擴增：將培養(yǎng)基替換為預(yù)熱的Neurobasal?-A培養(yǎng)基（含1%100×GlutaMAX、2%50×B27、1%青霉素/鏈霉素、20ng/mLEGF、20ng/mLFGF2），每孔2mL液體，前10天每天更換培養(yǎng)基液，后面九天隔天更換培養(yǎng)基。7.1.1.6D25~D43背側(cè)前腦類器官分化：將培養(yǎng)基替換為預(yù)熱的Neurobasal?-A培養(yǎng)基（含1%100×GlutaMAX、2%50×B27、1%青霉素/鏈霉素、20ng/mLBDNF、20ng/mLNT3），每孔2mL液體，隔天換液。7.1.1.7D44~:背側(cè)前腦類器官維持：將培養(yǎng)基替換為預(yù)熱的Neurobasal?-A培養(yǎng)基（含1%100×GlutaMAX、2%50×B27、1%青霉素/鏈霉素），每孔2mL液體，3~4天換液。7.1.2心臟類器官構(gòu)建7.1.2.1心臟類器官宜采用人胚胎干細(xì)胞H9構(gòu)建，培養(yǎng)于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中。7.1.2.2使用Accutase消化液將H9細(xì)胞解離成單細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)，并用含有10μMY27632的TeSR?E8?培養(yǎng)基重懸，然后以10000細(xì)胞/孔的量，將細(xì)胞接種到低吸附處理的96孔板中，300g離心4min。7.1.2.324h后（記為Day-1），更換不含Y27632的TeSR?E8?培養(yǎng)基24小時。7.1.2.4Day0使用含有1ng/mLActivinA、1.25ng/mLBMP-4、4μMCHIR-99021的B27培養(yǎng)基（不含胰島素）處理24h。7.1.2.5Day1更換B27培養(yǎng)基（不含胰島素）24h。7.1.2.6Day2利用含有2μMWnt-C59的B27培養(yǎng)基（不含胰島素）培養(yǎng)2d。7.1.2.7Day4更換B27培養(yǎng)基（不含胰島素）繼續(xù)培養(yǎng)2d。7.1.2.8Day6更換B27培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。7.1.2.9Day7用2μMCHIR-99021的B27培養(yǎng)基處理1小時；之后每2d更換一次B27培養(yǎng)基，直到Day16培養(yǎng)結(jié)束。7.1.3肺類器官構(gòu)建7.1.3.1肺類器官宜采用小鼠肺組織構(gòu)建，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.1.3.2將小鼠用75%酒精徹底消毒皮膚，無菌分離肺組織并置于預(yù)冷的無菌PBS溶液中漂洗，清除結(jié)締組織及肺內(nèi)主支氣管，分離肺葉，清洗2次～3次去血。7.1.3.3無菌鑷子轉(zhuǎn)移清洗后的肺葉于新的培養(yǎng)皿中，吸除殘留的PBS，用眼科手術(shù)剪將肺組織均勻剪成約1mm3的組織塊，轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的膠原酶消化溶液中，37℃恒溫?fù)u床（100轉(zhuǎn)r/min）消化45min~60min。7.1.3.4加入等量的含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻后，使用100μm細(xì)胞篩過濾；過濾液4℃300g離心5min，棄上清。7.1.3.5加入3mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞沉淀，室溫孵育1min~2min，加入6mLDMEM/F12培養(yǎng)基混勻，4℃300g離心5min，棄上清；重復(fù)上述步驟2次，直至細(xì)胞沉淀變白。7.1.3.6加入4mLDNA酶溶液（20U/mL）重懸細(xì)胞沉淀，室溫手搖3min～5min；加入6mLDMEM/F12培養(yǎng)基混勻，4℃300g離心5min，棄上清。7.1.3.7按照2×107/mL細(xì)胞數(shù)量重懸于40μLMatrigel基質(zhì)膠中，并接種至24孔板中央。7.1.3.8待Matrigel基質(zhì)膠凝固后，加入600μL小鼠肺類器官培養(yǎng)基，每隔2d天更換培養(yǎng)基，第14d即得到肺類器官。7.1.4腸類器官構(gòu)建7.1.4.1腸類器官宜采用小鼠腸組織構(gòu)建，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.1.4.2在靠近小鼠胃的一端取長度約20cm小腸，去除腸道絨毛、血管和脂肪。4DBXX/TXXXX—XXXX7.1.4.3將腸段縱向切開，用預(yù)冷的PBS輕輕洗滌腸道，直至清洗干凈。7.1.4.4將腸組織剪成2mm片段，用預(yù)冷的PBS反復(fù)沖洗，直至上清液澄清。7.1.4.5除去上清液，將組織碎片重懸于4mL含有5mMEDTAPBS中。7.1.4.6用槍頭吹打、重懸含有消化液的組織碎片，使組織反復(fù)穿過移液管以產(chǎn)生機械剪切力，從而使腸隱窩與基底層分離。7.1.4.7加入4mL小鼠腸類器官培養(yǎng)基終止消化。7.1.4.8用100μm細(xì)胞篩過濾組織懸液，過濾液4℃300g離心5min，棄上清。7.1.4.9顯微鏡下計數(shù)腸隱窩數(shù)量。7.1.4.10按照每10μLMatrigel基質(zhì)膠含200個～600個腸隱窩密度，接種至24孔板中。7.1.4.11待Matrigel基質(zhì)膠凝固后，加入600μL小鼠腸類器官培養(yǎng)基，每隔2d更換培養(yǎng)基，第7d天即得到腸類器官。7.1.5肝類器官構(gòu)建7.1.5.1肝類器官宜采用小鼠肝組織構(gòu)建，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.1.5.2取小鼠肝臟，放入預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)基中漂洗2次。7.1.5.3使用無菌剪刀將肝臟剪碎至1mm3大小，轉(zhuǎn)移至離心管中，靜置2min后，去除上清。7.1.5.4放入消化液10mL（Dispase、IV型膠原酶、DMEM/F12培養(yǎng)基，按1：1：6配比），37℃水浴20min。7.1.5.5機械吹打后，靜置1min，去除上清。7.1.5.6上述步驟重復(fù)3次，收集上清液，冰上保存。7.1.5.7用70μm細(xì)胞篩過濾組織懸液，收集過濾液。7.1.5.8用30μm細(xì)胞篩過濾，收集細(xì)胞篩網(wǎng)截留的肝細(xì)胞。7.1.5.9按照2×107/mL細(xì)胞數(shù)量重懸于40μLMatrigel基質(zhì)膠中，并接種至24孔板中央。7.1.5.10待Matrigel基質(zhì)膠凝固后，加入600μL小鼠肝類器官培養(yǎng)基，每隔2d更換培養(yǎng)基，第14d即得到肝類器官。7.2類器官毒性測試評價7.2.1評價方法采用類器官培養(yǎng)基，將受試化學(xué)品按一定比例（推薦1：4）逐級稀釋，生成具有梯度濃度的稀釋液。小心吸出培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基（不要觸碰膠滴加入含受試化學(xué)品的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)類器官種類不同，檢測相應(yīng)的指標(biāo)，以反映化學(xué)品對類器官毒性的大小。7.2.2評價指標(biāo)7.2.2.1腦類器官檢測指標(biāo)應(yīng)包括但不限于下列內(nèi)容。a)類器官生長速率，參考附錄A的方法檢測。b)參考附錄B的方法，檢測腦類器官標(biāo)志物表達(dá)水平，包括：1)神經(jīng)元標(biāo)志物，如微管相關(guān)蛋白2（MAP2）；2)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）。7.2.2.2心臟類器官檢測指標(biāo)應(yīng)包括但不限于下列內(nèi)容。5DBXX/TXXXX—XXXXa)類器官生長速率，參考附錄A的方法檢測。b)參考附錄B的方法，檢測心類器官標(biāo)志物表達(dá)水平，包括：1)肌成纖維細(xì)胞，如鈣調(diào)蛋白（calponin2)內(nèi)皮細(xì)胞，如血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（CD31）、VE-鈣粘蛋白（CD144）。7.2.2.3肺類器官檢測指標(biāo)應(yīng)包括但不限于下列內(nèi)容。a)類器官生長速率，參考附錄A的方法檢測。b)參考附錄B的方法，檢測肺類器官分子標(biāo)志物變化水平，包括：1)上皮標(biāo)志物，如上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）；2)增殖標(biāo)志物，如Ki-67；3)分化標(biāo)志物，如AcetylatedTubulin。7.2.2.4腸類器官檢測指標(biāo)應(yīng)包括但不限于下列內(nèi)容。a)類器官生長速率，參考附錄A的方法檢測。b)參考附錄B的方法，檢測腸類器官分子標(biāo)志物變化水平，包括：1)杯狀細(xì)胞，如黏蛋白2（Muc2）；2)潘氏細(xì)胞，如溶菌酶（Lyz）；3)吸收細(xì)胞，如鈣調(diào)肌動蛋白（Villin）。7.2.2.5肝類器官檢測指標(biāo)應(yīng)包括但不限于下列內(nèi)容。a)類器官生長速率，參考附錄A的方法檢測。b)參考附錄B的方法，檢測肝類器官分子標(biāo)志物變化水平，包括：1)白蛋白（ALB）；2)甲胎蛋白（AFP）；3)細(xì)胞角蛋白19（CK19）。6DBXX/TXXXX—XXXX（資料性）類器官生長速率檢測A.1儀器設(shè)備儀器設(shè)備包括但不限于：a)光學(xué)顯微鏡；b)臺式定軌振蕩器（含加熱功能c)多功能酶標(biāo)儀。A.2試劑CCK-8試劑。A.3試驗方法試驗方法如下：a)