氟化嵌段聚合物的應(yīng)用

II1引言1.1腫瘤治療概述惡性腫瘤威脅人類的生命。腫瘤會隨著身體內(nèi)細胞的增長和轉(zhuǎn)移發(fā)生惡化，最終導致人的死亡。腫瘤的一般治療方法有手術(shù)治療，主要用于實體瘤病人，許多腫瘤可通過手術(shù)切除治療達到治愈或延長生命的效果；也可以通過應(yīng)用化學藥物來抑制或殺死腫瘤細胞，化療通常用于全身性治療，適用于廣泛轉(zhuǎn)移或無法通過手術(shù)完全切除的腫瘤，還有一些放射治療等等[1]。傳統(tǒng)治療腫瘤方法雖然在一定程度上可以控制疾病發(fā)展，但也存在較大的副作用。研究人員花費了大量的人力物力去研究治療腫瘤的方案，但是結(jié)果都不盡人意。直至近年，研究人員開發(fā)了新型的癌癥治療手段——光動力療法(photodynamictherapy,PDT)。PDT可以產(chǎn)生活性氧殺傷腫瘤細胞，誘導免疫原性細胞死亡[2]。光動力治療具有許多優(yōu)點，準確度高，效率高，治療效果好，副作用低等。PDT僅將光源引導到體內(nèi)進行治療，盡可能的避免了手術(shù)造成的創(chuàng)傷和痛苦，能較快的使病人恢復[3]。光動力療法是基于光敏劑、氧氣和光源三種物質(zhì)的相互作用的癌癥治療方法，作為一種安全高效的腫瘤治療方式,在現(xiàn)代醫(yī)學領(lǐng)域具有極廣闊的應(yīng)用前景。光動力治療法的治療效果取決于腫瘤組織中的氧氣含量，但絕大部分實體腫瘤都存在乏氧環(huán)境,氧氣含量顯著低于正常組織,使得光動力治療的療效受到了很大的影響[4]。目前大多研究主要通過改善腫瘤微環(huán)境缺氧問題提高PDT療效。1.2腫瘤乏氧環(huán)境腫瘤微環(huán)境（tumormicroenvironment,TME）是由成纖維細胞、免疫細胞、髓系細胞等多種細胞和物質(zhì)組成的腫瘤細胞生存的直接環(huán)境，與人體正常組織環(huán)境有不同的特征[5]。腫瘤乏氧是腫瘤組織關(guān)鍵特征之一，腫瘤細胞及細胞周圍沒有足夠的氧分子，比正常的細胞組織的氧分子濃度低。腫瘤細胞的代謝活動比正常細胞更為活躍，需要更多的氧氣供應(yīng)，但腫瘤內(nèi)部的血管結(jié)構(gòu)異常，無法有效提供足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)[6]，使其自身形成乏氧環(huán)境。乏氧微環(huán)境導致腫瘤對治療產(chǎn)生抵抗性，降低PDT的療效。乏氧環(huán)境還能夠刺激腫瘤細胞發(fā)生變化，以適應(yīng)乏氧環(huán)境，同時可能導致腫瘤細胞改變微環(huán)境，加劇腫瘤細胞部位的乏氧問題，進一步導致癌癥的惡化?？鼓[瘤納米藥物的效果被限制就是因為腫瘤乏氧微環(huán)境的存在[7]，導致癌癥治療受到阻礙。1.3含氟聚合物在抗腫瘤活性方面的應(yīng)用在光動力治療過程中，腫瘤的缺氧問題成為阻礙治療效果的關(guān)鍵因素。嵌段聚合物作為一種具有多功能的材料，在抗腫瘤活性研究中展現(xiàn)出與光動力治療的聯(lián)合潛力，能有效改善腫瘤缺氧問題[8]。嵌段聚合物在藥物傳遞領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，其結(jié)構(gòu)可調(diào)、生物相容性高、載藥能力強以及具備靶向性等特點[9]，使得它能夠被設(shè)計成為控制藥物釋放的載體，并實現(xiàn)藥物在體內(nèi)的精準遞送。這些優(yōu)勢讓嵌段聚合物在抗腫瘤治療領(lǐng)域具備巨大的應(yīng)用潛力。含氟聚合物因氟原子的特殊性質(zhì)——強電負性、范德華半徑小和C—F鍵能高，展現(xiàn)出了雙疏性（同時具備疏水性和疏油性）、高化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性以及生物相容性等特性[10]。氟化自組裝聚合物的溶氧性使得它能夠運輸大量氧氣，從而有效改善腫瘤的缺氧環(huán)境。與單一的光動力治療相比，這種結(jié)合了藥物緩解缺氧和光動力治療的協(xié)同治療方式有望顯著提高癌癥的治療效果。綜上所述，含氟嵌段聚合物因其獨特的結(jié)構(gòu)和性能，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。1.4文章的選題思路和研究方向癌癥，作為全球范圍內(nèi)的一大健康難題，給人類的生命與健康帶來了沉重的負擔。傳統(tǒng)的癌癥治療手段，諸如化療與放療，盡管在一定程度上能夠遏制疾病的進展[11]，但其所存在的局限亦不容忽視。例如，腫瘤細胞在長時間的化療過程中可能產(chǎn)生耐藥性，導致治療效果大打折扣，這些治療手段還可能對正常細胞造成損傷，引發(fā)一系列副作用，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。而PDT能有效解決傳統(tǒng)癌癥治療手段中的這些問題。PDT中光敏劑在特定波長的光源的照射下,消耗氧氣產(chǎn)生毒性活性氧(ROS),從而有效誘導癌細胞凋亡和壞死。激光、光敏劑以及氧氣本身都是無害的,所以PDT對于正常組織和細胞都具有較低的毒副作用[12]。腫瘤缺氧微環(huán)境導致腫瘤對治療產(chǎn)生抵抗性，降低PDT的療效[13]。因此,緩解腫瘤缺氧對于增強光動力治療療效具有重要的意義。本實驗利用含氟聚合物PEGAF，這種納米材料憑借其獨特性能，能夠有效地緩解腫瘤缺氧狀態(tài)并促進光動力治療（PDT）的效果。光敏劑通常具有疏水性，因此面臨著生物利用度不高以及腫瘤靶向性差的缺點[14]。而含氟聚合物PEGAF的設(shè)計巧妙地在其疏水核心中融入了光敏劑Ce6，從而克服了這些缺點。此外，由于該聚合物的氟元素含量高，它展現(xiàn)出了良好的載氧能力，為緩解腫瘤缺氧微環(huán)境提供了可靠的解決方案。在實驗中，我們利用660nm激光照射，發(fā)現(xiàn)Ce6能夠高效地生成有毒的單重態(tài)氧（1O2），這一過程有效地改善了腫瘤組織的乏氧環(huán)境。為了全面評估所制備的氟化聚合物的性能，我們進一步檢測了其載氧能力、載藥能力以及ROS生成能力。不僅如此，我們還深入探討了負載了O2和Ce6的氟化聚合物在抗癌方面的潛力，旨在揭示其在癌癥中的治療能力。2實驗內(nèi)容與方法2.1實驗相關(guān)試劑本實驗使用的主要試劑有蒸餾水、75%酒精、青霉素、鏈霉素、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMEM）、活性氧探針（DCFH-DA）、PBS等。2.2實驗相關(guān)儀器本實驗使用的主要儀器有生物安全柜、細胞培養(yǎng)箱、離心機、激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)、熒光分光光度計、便攜式溶解氧儀（YSI550A）等。2.3PEGAF中溶氧量的測定由于含氟自組裝聚合物作為氧氣載體具有高溶氧性的特點。實驗中使用攜式溶解氧儀進行水溶液中氧濃度的測定。向試劑瓶中通入氮氣對10mL的蒸餾水做凈化處理。接著在溶液中加入10mgPEGAF，通過通入氧氣的方式讓其裝載氧氣，這一過程持續(xù)了15分鐘。然后將氧探針插入溶液中，用便攜式溶氧儀對溶液中的氧濃度連續(xù)測量30分鐘，觀察氧氣的變化。設(shè)置對照組，比較通入氧氣后PEGAF溶液中的含氧量與水和PBS中的含氧量。2.4PEGAF@Ce6的體外活性氧生成能力熒光成像技術(shù)相比于傳統(tǒng)成像技術(shù)靈敏度高、而且操作簡單和分辨率高,熒光成像技術(shù)是一種基于熒光物質(zhì)與激發(fā)光相互作用產(chǎn)生熒光信號的技術(shù)。當熒光物質(zhì)受到激發(fā)光的照射時，它們會吸收激發(fā)光的能量，并將其轉(zhuǎn)化為熒光。熒光的波長比激發(fā)光的波長更長，因此可以通過檢測熒光的波長和強度來獲取被檢測物體的信息。在熒光成像中，通常使用熒光染料或熒光蛋白等熒光物質(zhì)來標記被檢測物體，然后使用激發(fā)光源來照射被檢測物體，使熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。最后，使用熒光顯微鏡或其他成像設(shè)備來檢測熒光的波長和強度，并將其轉(zhuǎn)換為圖像信息[15]。本實驗中通過熒光光譜技術(shù)來評估單線態(tài)氧的生成情況。為了深入探究PEGAF納米顆粒包裹光敏劑Ce6后在溶液環(huán)境中單線態(tài)氧的產(chǎn)生能力，我們分別將15mg的PEGAF@Ce6和游離態(tài)的Ce6加入到3mL的去離子水中。對這些樣品進行10分鐘的氧化處理，并在此基礎(chǔ)上加入了30μM的SOSG溶液。接下來，我們使用強度為0.5W/cm2、波長為660納米的激光對這些樣品進行了10分鐘的照射，利用熒光分光光度計，在525nm處（激發(fā)波長：504nm）測量了樣品的熒光強度，準確地評估了單線態(tài)氧的生成情況。2.5細胞的培養(yǎng)本實驗要在細胞培養(yǎng)室里準備，在無菌的條件下，把所需的藥品和試劑都準備好。先把培養(yǎng)基預熱到室溫，為了確定是否更換培養(yǎng)液或進行傳代，可利用倒置顯微鏡觀察。將凍存的鼠乳腺癌細胞4T1細胞取出后復蘇，放入到DMEM培養(yǎng)基（10%（v/v）胎牛血清、100U/mL青霉素和100ug/mL鏈霉素）中進行培養(yǎng)，輕輕吹勻后離心，制成細胞懸液，接種于DMEM培養(yǎng)皿中，在37℃且含5%的CO2的條件下培養(yǎng)。更換培養(yǎng)液時加入3mL的DMEM即可。進行細胞傳代時在培養(yǎng)基中加入胰蛋白酶進行消化，消化時最佳溫度是37℃。消化后，傳代繼續(xù)培養(yǎng)等待后續(xù)實驗。在細胞的培育過程中，我們必須時刻保持培養(yǎng)環(huán)境的潔凈無菌，這是確保細胞健康生長的關(guān)鍵。任何微小的污染都可能對細胞的生長產(chǎn)生不利影響，因此我們必須嚴格遵循無菌操作規(guī)范，避免任何潛在的污染源。同時，我們還需要定期觀察細胞的生長情況，密切關(guān)注它們的狀態(tài)和變化，以便及時調(diào)整培養(yǎng)條件，確保細胞能夠在最佳的環(huán)境中生長和繁殖。并且記錄細胞的傳代次數(shù)和生長情況，以便后續(xù)實驗使用。2.6PEGAF@Ce6細胞內(nèi)活性氧的生成能力為了在細胞水平評估單態(tài)線氧的生成能力，我們采用了熒光光譜技術(shù)，通過熒光光譜使用DCFH-DA為熒光探針。具體操作如下：首先，在1.5mL的細胞懸液中加入含有4μg/mLCe6的PEGAF@Ce6溶液，確保細胞在培養(yǎng)箱中孵育兩小時，使納米顆粒充分與細胞作用。隨后，用PBS對細胞進行一次洗滌，再加入1.5mL的DCFH-DA探針繼續(xù)孵育半小時。完成孵育后，用PBS再次洗滌細胞兩次，以去除多余的探針。接下來，用660nm的激光對每個培養(yǎng)皿照射十分鐘，以激發(fā)熒光反應(yīng)。最后，通過熒光分光光度計測定細胞在525nm波長處的熒光強度，分析綠色熒光的強度來評估活性氧的生成能力。2.7PEGAF@Ce6細胞內(nèi)光動力毒性測試為了深入探究PEGAF@Ce6納米顆粒對腫瘤細胞的毒性效應(yīng)，我們在此采用了MTT比色法來評估腫瘤細胞存活率。將不同濃度的PEGAF和PEGAF@Ce6納米顆粒分別加入到含有5%CO2的培養(yǎng)箱中的細胞中，并使其進行孵育。實驗分為兩組，一組為激光組，另一組為非激光組。在孵育了4個小時后，我們使用660納米的激光對激光組進行照射，照射時間為10分鐘，而非激光組則保持不做任何處理。隨后，我們將兩組細胞繼續(xù)孵育培養(yǎng)20個小時，以便充分觀察其生長情況。隨后，我們在已經(jīng)處理完畢的細胞中加入了10μL的5mg/mLMTT溶液，以便進一步評估細胞的活性。接下來，將這些細胞置于37℃、含有5%CO2的培養(yǎng)箱中，確保它們能夠在適宜的環(huán)境下孵育4個小時。孵育完成后，我們輕輕吸出了上清液，以避免對后續(xù)實驗造成干擾。然后，在每個孔中加入了150μL的二甲基亞砜（DMSO），使其顯色。最后，我們使用多功能酶標儀測量了這些細胞在570nm波長處的吸光度。通過比較不同樣本之間的吸光度差異，準確地評估PEGAF@Ce6納米顆粒對細胞活力的影響。這一實驗步驟不僅幫助我們了解了納米顆粒與細胞相互作用的機制，還為后續(xù)研究提供了重要的數(shù)據(jù)支持。3結(jié)果與討論3.1PEGAF的載氧能力由于氟化自組裝聚合物作為氧氣載體存在著優(yōu)異的特點，比如說高溶氧性，氟原子的存在使其能運輸大量的氧氣，有效改善了腫瘤組織中的缺氧環(huán)境。通入氮氣以排除溶液中溶解的氣體，隨后通入過量氧氣使溶液達到飽和狀態(tài)。使用便攜式溶解氧儀監(jiān)測了不同溶液中氧濃度的變化，以探究PEGAF的攜氧能力及其釋放行為（如圖1所示）。觀察圖1，我們可以清晰地看到，即便在1800s的監(jiān)測時間中，PEGAF仍然能夠保持高達18mg/mL的氧濃度。相比之下，對照組的PBS溶液和水中的氧濃度則呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢，最終降至16mg/mL以下。這一對比結(jié)果充分表明，與水和PBS相比，PEGAF能夠維持更為恒定且較高的氧濃度。綜上所述，我們得出結(jié)論：PEGAF可以長時間儲存氧氣，為缺氧腫瘤提供可靠的氧氣供應(yīng)。圖1通入氧氣后PEGAF溶液中的含氧量與水和PBS中的含氧量對比3.2PEGAF@Ce6納米顆粒的體外活性氧生成性能評價在實驗過程中升高的氧氣濃度促進了活性氧的生成，導致了細胞造成大量的損傷，為了檢測PEGAF@Ce6產(chǎn)生單線態(tài)氧（1O2）的產(chǎn)生能力，并且檢測活性氧的產(chǎn)生量，我們在研究過程中使用SOSG和DCFH-DA作為探針來評估。圖2不同溶液熒光強度隨波長的變化如圖2所示，對于不同的波長光線，PEGAF@Ce6產(chǎn)生的熒光強度明顯高于Ce6和蒸餾水。在525nm波長處，熒光強度達到了峰值。這充分證明，PEGAF@Ce6納米顆粒在生成單線態(tài)氧方面的能力遠勝于Ce6和蒸餾水。3.3PEGAF@Ce6的細胞內(nèi)ROS生成能力先前的實驗已充分驗證了溶液中單態(tài)氧的產(chǎn)生能力。為了進一步深入了解這一過程中細胞內(nèi)活性氧的生成情況，我們采用了激光共聚焦顯微鏡（CLSM）技術(shù)。如圖3所示，首先，我們利用熒光染料DCFH-DA對細胞進行了染色處理。這種染料具有高度的特異性和靈敏度，能夠在細胞內(nèi)被活性氧氧化后發(fā)出明亮的綠色熒光。通過CLSM的觀察，我們可以看到第一行中的細胞被DCFH-DA染色，PEGAF@Ce6處理的細胞表現(xiàn)出微弱的綠光，PEGAF@Ce6+L處理的細胞表現(xiàn)出較強的熒光綠，而PBS處理的細胞熒光很暗淡，幾乎沒有熒光。這直觀地反映了細胞內(nèi)的活性氧濃度。同時，我們利用Hoechst染料對細胞的細胞核進行了染色。這種染料能夠特異地與細胞核中的DNA結(jié)合，使其呈現(xiàn)出清晰的藍色輪廓。在CLSM下，我們可以清晰地看到第二行中細胞的細胞核被染成了藍色，與周圍的細胞質(zhì)形成了鮮明的對比。最后，我們將DCFH-DA和Hoechst兩種染色的圖像進行了疊加處理，得到了細胞內(nèi)活性氧分布的綜合圖像。為了更深入地研究細胞內(nèi)活性氧的生成量，我們還利用激光共聚焦顯微鏡捕捉了綠色熒光圖像，并制作了熒光強度定量分析圖（如圖4所示）。通過對比不同處理條件下細胞的熒光強度，我們可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PEGAF@Ce6處理的細胞在激光照射下呈現(xiàn)出較強的熒光信號，而PBS處理的細胞熒光則相對較弱。熒光強度直接反映了細胞內(nèi)活性氧生成量的增加。這一現(xiàn)象進一步表明，納米材料在產(chǎn)生活性氧方面的能力得到了顯著提升。根據(jù)我們的實驗結(jié)果，PEGAF@Ce6納米顆粒在產(chǎn)生活性氧方面的表現(xiàn)明顯優(yōu)于PBS，其生成活性氧的能力更強。這一結(jié)果不僅進一步驗證了PEGAF@Ce6在細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧的能力，也為我們后續(xù)研究其在光動力治療中的應(yīng)用提供了重要的實驗依據(jù)。圖3使用激光共聚焦顯微鏡拍攝的不同組分處理細胞后的活性氧熒光強度圖4使用激光共聚焦顯微鏡定量分析各組分的熒光強度。3.4PEGAF@Ce6細胞光動力毒性測試在光動力治療中，活性氧的產(chǎn)生會導致腫瘤細胞死亡。為了驗證不同試劑的光動力效應(yīng)，我們采用了MTT比色法，探究了PEGAF@Ce6納米顆粒的細胞毒性。首先，我們測試了單獨PEGAF對細胞的毒性。實驗結(jié)果顯示，不管是在什么濃度范圍內(nèi)，細胞的存活率依然保持在百分之八十以上，這充分證明了PEGAF本身對細胞的毒性較低。接著，我們進一步測試了PEGAF@Ce6的細胞毒性。實驗分為兩組進行，一組在有660nm激光照射的條件下進行，另一組則無激光照射。結(jié)果顯示，在有激光照射的條件下，細胞的存活率相比于無激光照射組有明顯的下降。這一發(fā)現(xiàn)表明，在激光的激發(fā)下，PEGAF@Ce6納米粒子能夠產(chǎn)生更多的活性氧，從而顯著增強了光動力治療的效果，最終導致腫瘤細胞的死亡。綜上所述，PEGAF@Ce6納米粒子在660nm激光照射下產(chǎn)生的活性氧更多，能增強光動力治療效果，最終導致腫瘤細胞的死亡。圖5PEGAF的細胞毒性圖6激光和無激光作用下PEGAF@Ce6的細胞毒性4結(jié)論在本次實驗中，評估了含氟嵌段聚合物PEGAF的載氧能力、載藥能力和ROS生成能力。通過便攜式溶解氧儀監(jiān)測比較了PEGAF與水和PBS中的氧的濃度，得出PEGAF可以長時間儲存氧氣，為缺氧腫瘤提供可靠的氧氣供應(yīng)的結(jié)論；通過檢測熒光強度比較PEGAF@Ce6、游離Ce6和蒸餾水產(chǎn)生的單態(tài)氧的含量，實驗表明了PEGAF@Ce6納米顆粒產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力比游離Ce6和蒸餾水產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力強；利用熒光染料探究細胞內(nèi)ROS的生成含量，實驗結(jié)果PEGAF@Ce6納米顆粒產(chǎn)生活性氧的能力強于PBS；最后，通過光動力毒性測試，在660nm激光照射下PEGAF@Ce6納米粒子產(chǎn)生的活性氧更多，能增強光動力治療效果，最終導致腫瘤細胞的死亡。綜上所述，PEGAF可以包裹Ce6顯著增強了光動力治療效果，此次研究說明了在光動力治療的過程中氟化嵌段聚合物PEGAF通過包裹氧氣和光敏劑，產(chǎn)生的活性氧可緩解乏氧環(huán)境的問題，大大提高了腫瘤治療的效率。這一發(fā)現(xiàn)讓我們對含氟嵌段聚合物在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景充滿了無限期待，相信未來它將在抗擊癌癥的戰(zhàn)斗中發(fā)揮更加重要的作用。參考文獻趙印民.具有毒性自由基和改善乏氧微環(huán)境的納米劑在腫瘤治療中的應(yīng)用[D].西南大學,2024.張校,任亞麗,王海萍,等.光動力療法聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療消化道腫瘤的研究進展[J].胃腸病學和肝病學雜志,2024,33(03):319-323.潘業(yè)婷.基于金屬有機框架（MOFs）的仿生納米遞送系統(tǒng)的構(gòu)建及其用于乏氧腫瘤的光動力治療[D].魯東大學,2021.許京倫.肝細胞癌腫瘤微環(huán)境的分析及其對治療方法及預后的指導[D].吉林大學,2024.吳朋飛,楊智,李青晏,等.腫瘤微環(huán)境中細胞代謝相互作用的研究進展[J].四川大學學報(醫(yī)學版),2024,55(02):482-489.PetrovaV,Annic