T-GXAS 781-2024 肉類(lèi)產(chǎn)品動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 擴(kuò)增子測(cè)序法

GXASI本文件參照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院、廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心、廣西愛(ài)生生命本文件主要起草人：甘永琦、張贊、朱斌、樊蘭艷、韋濤、陳曉東、王逸叢、巫堅(jiān)、羅衛(wèi)姚雪瑩、譚慧敏、黃曉韻、陳曉春、鄭義友、薛亞馨、蘆志龍1肉類(lèi)產(chǎn)品動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法擴(kuò)增子測(cè)序法測(cè)，以及同類(lèi)型動(dòng)物組織制成的肉類(lèi)產(chǎn)品中動(dòng)物成分的定量檢測(cè)。檢出限為0.1%，定量限為5%（質(zhì)量分GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格GB/T30989高通量基因測(cè)序技GB/T40226環(huán)境微生物宏基因組檢測(cè)高通量測(cè)GB/T40664—2021用于高通量測(cè)序的核酸類(lèi)樣本質(zhì)量控制通用SN/T3500進(jìn)出口食品安全生T/CSES81淡水生物監(jiān)測(cè)環(huán)境DN擴(kuò)增子測(cè)序ampliconsequ高通量基因測(cè)序high-throughputge堿基識(shí)別質(zhì)量qualityofbasecal2生物體細(xì)胞核或者細(xì)胞器中能夠代表該物種的線(xiàn)粒體基因組上編碼核糖體小亞基16Sr操作分類(lèi)單元operationaltaxonomicun分子分類(lèi)單元molecularta4縮略語(yǔ)CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（CetyltrimetDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcNa2EDTA：乙二胺四乙酸二鈉（EthylenediaminetetraaceticaTris：三（羥甲基）氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）Aminometha結(jié)合DNA條形碼技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品中動(dòng)物除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水）：3）：），）：），）：8.12冰箱：-20℃和2℃~8℃。9樣品采集與處理9.1樣品采集應(yīng)使用不同的采樣器具采集不同的樣品。采樣抽樣按GB/T9695.19和SN/T3500的9.2樣品處理9.2.1肉品、內(nèi)臟、角骨、皮張9.2.2毛發(fā)4取0.5g樣品中入50mL離心管，加入2倍體積的無(wú)菌水（7.20），上下顛倒充分混勻，8500rpm離心5min并棄去上清液，重新加入2倍體積的無(wú)菌水（7.20），上下顛倒充分混勻，8500rpm離心5min），），），置20min，12000rpm離心10min），的RNaseA（7.6），輕彈均勻后，37℃酶解作用30min；DNA置于-注：上述方法均可使用等效的DNA提取試劑盒提取樣品DNA。正向引物PR2-F和反向引物PR2-R（見(jiàn)表1）用于擴(kuò)增各樣品16SrDNA的目標(biāo)片段。在擴(kuò)增引物PR2引物序列5’-3’ATAAGACGAGAAGACCCTACATCGAGGTCGTAAACC在冰上（-10℃~0℃)制備以下PCR反應(yīng)液并混勻：PCR聚合酶混合液（7.4）12.5μL、正反向引5稱(chēng)取適量的瓊脂糖（7.13）粉末，加入電泳緩沖液，使瓊脂糖終濃度為1％，充分溶化，加入核酸染料（7.12制膠。取2μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和適量加樣緩沖液（7.11）混合，點(diǎn)樣，9V/c個(gè)質(zhì)檢合格的文庫(kù)按比例混合后，選擇合適的測(cè)序讀長(zhǎng)進(jìn)別質(zhì)量（一般＞Q20）和序列長(zhǎng)度（一般大于預(yù)期長(zhǎng)度的70進(jìn)行序選用OTU方法進(jìn)行序列聚類(lèi)和質(zhì)量控制，獲得分子分類(lèi)單元，并過(guò)濾錯(cuò)誤序列。將相似性高于或等％）6品中檢測(cè)出XX動(dòng)物源性成分，物種占比為X%，空白對(duì)照檢測(cè)結(jié)果正常”。a)檢測(cè)機(jī)構(gòu)名稱(chēng)、聯(lián)系方式和地址、檢測(cè)員、樣品接收時(shí)間及報(bào)告時(shí)間；b)測(cè)序平臺(tái)與測(cè)序策略。7A.1.1將AMPureXP磁珠（7.1）于室溫放置30min。使用前渦旋AMPureXP磁珠（7.A.1.5在室溫下靜置孵育10min。A.1.6將1.5mL離心管或微孔板置于磁力架上，室溫放置2min，直至上清液澄清。A.1.7吸取上清液并丟棄，勿觸碰磁珠。A.1.8將1.5mL離心管或微孔板置于磁力架上，用新制備的80％乙醇（7.18）洗滌磁珠，操作如下：c)小心吸取并丟棄上清液，勿觸碰磁珠。A.1.9重復(fù)步驟A.1.8一次，A.1.10在室溫下將離心管或微孔板置于磁力架上晾干10min～15min。A.1.12輕輕上下吸吹10次，確保磁珠再懸浮。A.1.13將離心管或平板在室溫下孵育5min。A.1.14將離心管或平板置于磁力架上至少5min，直至上清液澄清。A.1.16進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或置于-25℃~-15℃下儲(chǔ)存。A.2文庫(kù)定量A.2.3文庫(kù)通過(guò)質(zhì)檢后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或置于-25℃~-15℃下儲(chǔ)存。A.3文庫(kù)均一化和混合A.3.1根據(jù)PCR擴(kuò)增子的大小計(jì)算DNA濃度C(nMA.4文庫(kù)變性8A.4.1取200μL氫氧化鈉溶液（7.7）加入800μL水，混勻，制備成0.2效。從測(cè)序試劑盒中拿出HT1恢復(fù)至室溫，儲(chǔ)存在2℃~8℃,直到變性樣品。A.4.6根據(jù)表A.1將變性的20pM文庫(kù)稀釋到想要的濃度，推薦濃度A.4.7輕輕漩渦，再輕離心。A.5.1混合上述變性的PhiX質(zhì)控和變性的擴(kuò)增文庫(kù)，推薦擴(kuò)增文庫(kù)占比為5070％。例如：變性的A.5.3輕輕漩渦，立即放置冰上。A.6測(cè)序儀運(yùn)行設(shè)置A.6.2根據(jù)測(cè)序需要設(shè)置相應(yīng)工作流程參數(shù)：a)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序（可獲得完整的擴(kuò)增子序列2)SamplePrepKit：選擇“NexteraXT4)ReadType：選擇“PairedEn5)CyclesRead1：201Cycl2)SamplePrepKit：選擇“NexteraXT4)ReadType：選擇“SingleEn9B.1.1正向引物PR2-F和反向引物PR2-R用于擴(kuò)增各樣品的目標(biāo)片段，Spike-in-1F、Spike-in-1R和在擴(kuò)增引物PR2、Spike-in-1、Spike-in-2的5’端和3’端加入標(biāo)簽序列和測(cè)序接頭以區(qū)分不同樣品；B.1.3將制備好的反應(yīng)液放置PCR儀中進(jìn)行f)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或置于-25℃~-15℃下儲(chǔ)存。B.2.1將DNACleanBeads磁珠（7.1）于室溫放置30min。使用前渦旋DNACleanBB.2.5在室溫下靜置孵育10min。B.2.6將離心管或微孔板置于磁力架上，室溫放置2min～5min，直至上清液澄清。B.2.8將1.5mL離心管或微孔板置于磁力架上，用新制備的80％乙醇（7.18）洗滌磁珠，操c)小心吸取并丟棄上清液，勿觸碰磁珠。B.2.10將離心管或微孔板置于磁力架上，室溫干燥至磁珠表面無(wú)反光、無(wú)B.2.13將離心管或平板在室溫下孵育5min。B.2.14將離心管或平板置于磁力架上，室溫放置2min～5min，直至上清液澄清。B.2.16進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或置于-25℃~-15℃下儲(chǔ)存。布，預(yù)期大小約為380bp。B.3.3文庫(kù)通過(guò)質(zhì)檢后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或置于-25℃~-15℃下儲(chǔ)存。n——單個(gè)文庫(kù)取樣量，單位為納克（ngM——單個(gè)反應(yīng)所需混合文庫(kù)的總量，單位為納克（ngN——所需測(cè)序文庫(kù)數(shù)目。v——單個(gè)文庫(kù)取樣體積，單位為微升(n——單個(gè)文庫(kù)取樣量，單位為納克（ngB.4.2當(dāng)樣品量大時(shí)，為減少取樣誤差，可進(jìn)行X倍的混合文庫(kù)方案后，取1/X進(jìn)行后續(xù)的一步法DNBB.