T-HBIQA 0005-2024 人體血液中5種雷帕霉素靶蛋白類抑制劑藥物含量的測(cè)定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

ICS01.040.11CCSC10/29T/HBIQA人體血液中5種雷帕霉素靶蛋白類抑制劑Determinationoffiverapamycintargetproteininhibitorsinhumanbloodby2024-08-15發(fā)布河北省檢驗(yàn)檢疫學(xué)會(huì)發(fā)布T/HBIQA0005—2024本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由河北省檢驗(yàn)檢疫學(xué)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院、河北科技大學(xué)。本文件主要起草人：李揮、李怡霖、梁艷、宋莉、王婷。1T/HBIQA0005—2024人體血液中5種雷帕霉素靶蛋白類抑制劑藥物含量的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了人體血液中5種雷帕霉素靶蛋白類抑制劑藥物含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。本文件適用于人體血液中維妥色替，AZD8055，GDC-0941，依維莫司，替西羅莫司含量的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理樣品用乙腈提取、無水硫酸鎂鹽析、十八烷基鍵合硅膠（C18）凈化后，渦旋混勻、冷凍離心、氮吹復(fù)溶，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑和材料5.1試劑和材料除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1.2乙腈：色譜純。5.1.3甲酸：色譜純。5.1.4無水硫酸鎂。2T/HBIQA0005—20245.1.5N-丙基乙二胺（PSA）。5.1.6標(biāo)準(zhǔn)品：維妥色替（CAS號(hào)：1009298-59-2AZD8055（CAS號(hào)：1009298-09-2GDC-0941他克莫司（CAS號(hào)：104987-11-3）純度均≥98%。5.1.7混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：分別稱取維妥色替，AZD8055，GDC-0941，依維莫司，替西羅莫司1mg（精確到0.01mg)，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別配制成維妥色替，AZD8055，GDC-0941，依維莫司，替西羅莫司的儲(chǔ)備溶液，于-20℃保存至分析。5.1.8標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：取500μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5.1.7）至50mL量瓶中，加甲醇稀釋，混勻，得到1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.9內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的配制：稱取1mg（精確到0.01mg)他克莫司，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到0.1mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20℃保存至分析。5.1.100.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液：準(zhǔn)確移取甲酸1.0mL置于1L量瓶中，用水定容，混勻。6儀器設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）。6.2氮吹濃縮儀。6.3渦旋震蕩儀。6.4電子分析天平（精度0.01mg)。6.5高速冷凍離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速22000rpm）。7試樣制備全部血液樣本充分混勻后，在4℃、3000r/min條件下離心10min，取管內(nèi)上清液分裝，-80℃儲(chǔ)存待測(cè)。8試驗(yàn)步驟8.1試樣預(yù)處理取200μL血液試樣（7）于5mL離心管中，準(zhǔn)確加入2mL乙腈、400mg無水MgSO4和30mgC18進(jìn)行鹽析和凈化，渦旋混勻30s后，經(jīng)12000r/min，4℃的冷凍離心10min。取出200μL上清液，氮吹濃縮至干，加入500μL含有內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液作為復(fù)溶溶劑，復(fù)溶后渦旋混勻30s，過0.22μm微孔3T/HBIQA0005—2024濾膜，待測(cè)定。8.2標(biāo)準(zhǔn)曲線取相應(yīng)的空白樣品，按照7步驟進(jìn)行處理，用得到的空白樣品提取液，將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋，得到維妥色替、AZD8055、GDC-0941濃度為1、2、5、10、20、80ng/mL，依維莫司濃度為2.5、5、12.5、25、50、200ng/mL，替西羅莫司濃度為10、20、50、50、100、200、800ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（內(nèi)標(biāo)他克莫司的濃度為50ng/mL濃度由低到高進(jìn)行檢測(cè)，以分析物與內(nèi)標(biāo)定量離子的峰面積比值對(duì)質(zhì)量濃度作圖，做出內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。8.3儀器參考條件8.3.1液相色譜參考條件a.色譜柱：Zorbaxextend-C18RRHD(2.1×100mm，1.8μm)，或相當(dāng)者。b.流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸、2mmol/L乙酸銨的甲醇溶液；B相為0.1%甲酸、2mmol/L乙酸銨的水溶液。c.柱溫：40℃。d.進(jìn)樣體積：5μL。e.流速：0.3mL/min。梯度洗脫程序見表1：表1梯度程序洗脫表時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%12039557955920208.3.2質(zhì)譜參考條件a.電離方式：電噴霧電離，正離子模式。b.電噴霧電壓：3500V。c.鞘氣流速；50Arb。d.輔助氣流速：10Arb。e.離子傳輸溫度：325℃。4T/HBIQA0005—2024f.霧化溫度：350℃。e.碰撞氣:氬氣。其他質(zhì)譜條件見附錄A8.4測(cè)定8.4.1測(cè)定步驟將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到5種雷帕霉素靶蛋白抑制劑的質(zhì)譜響應(yīng)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中5種雷帕霉素靶蛋白抑制劑的濃度。樣品溶液中各組分的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣測(cè)定（內(nèi)標(biāo)物根據(jù)測(cè)定結(jié)果，添加與稀釋倍數(shù)相同倍數(shù)的內(nèi)標(biāo)量，開展前處理實(shí)驗(yàn)，稀釋后再進(jìn)樣分析）。8.4.2定性判定在相同條件測(cè)定樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的某種組分峰的保留時(shí)間一致（變化范圍在±2.5%），并且所選擇的兩對(duì)子離子的質(zhì)荷比一致，樣品溶液中定性離子相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較時(shí)，相對(duì)偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在該組分。5種雷帕霉素靶蛋白抑制劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖參見附錄B。表2定性確定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度>50%>20%~50%>10%~20%≤10%允許的相對(duì)偏差±20%±25%±30%±50%8.4.3數(shù)據(jù)計(jì)算血液樣本中各藥物濃度含量為：式中:Xi——試樣中待測(cè)組分含量，單位為納克每毫升(ng/mL)；ρi——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的測(cè)試液中某種組分的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；V定容——定容體積，單位為毫升(mL)；K——稀釋倍數(shù)；5T/HBIQA0005—2024V試樣——試樣體積，單位為毫升(mL)。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。8.5空白試驗(yàn)取空白血樣，按8.1-8.4測(cè)定步驟進(jìn)行。8.6定量限和重復(fù)性8.6.1方法定量限本方法維妥色替、AZD8055、GDC-0941定量限為1ng/mL，依維莫司為2.5ng/mL，替西羅莫司為10ng/mL。8.6.2重復(fù)性在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)條件下獲得兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算數(shù)平均值的15%。6T/HBIQA0005—2024（資料性附錄）質(zhì)譜參數(shù)表A.1目標(biāo)物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)和參考保留時(shí)間化合物母離子(m/z)子離子(m/z)碎裂電壓(V)碰撞電壓(V)參考保留時(shí)間(min)維妥色替463.20405.10a/347.12103383.56AZD8055466.25450.20a/334.1096433.66GDC-0941