分子生物學(xué)研究法-上-DNA、RNA及蛋白質(zhì)課件

5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達(dá)、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類(lèi)分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。基因工程技術(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過(guò)它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實(shí)上，這種跨越物種屏障、把來(lái)自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它生命科學(xué)技術(shù)的根本特征。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開(kāi)DNA分子。第一個(gè)核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實(shí)驗(yàn)室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識(shí)別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個(gè)位點(diǎn)切開(kāi)并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的主要工具酶5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)（二）基因克隆的載體載體三要素：自我復(fù)制能力攜帶外源基因片段大小插入位點(diǎn)多少大腸桿菌質(zhì)粒載體：1、pSC101質(zhì)粒載體長(zhǎng)9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7種限制性核酸內(nèi)切酶的單酶切位點(diǎn)，在HindIII、BamHI和SalI等3個(gè)位點(diǎn)插入外源基因，會(huì)導(dǎo)致tetr失活。是第一個(gè)真核基因克隆載體。缺點(diǎn)：它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1~2個(gè)拷貝，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取pSC101DNA，產(chǎn)量很低。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)2、ColE1質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒。一般情況下，當(dāng)培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或是在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復(fù)制便被抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)也隨之停止。松弛型質(zhì)粒DNA卻繼續(xù)復(fù)制數(shù)小時(shí)，使每個(gè)寄主細(xì)胞中ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)到1000~3000個(gè)，占細(xì)胞總DNA的50%左右。ColE1質(zhì)粒DNA復(fù)制起始部位調(diào)控因子之間關(guān)系前體RNA(RNAII)的轉(zhuǎn)錄起始于復(fù)制起點(diǎn)上游，需經(jīng)RNaseH加工后產(chǎn)生有555個(gè)核苷酸的引物，起始DNA合成。RNAI在RNAII的5’末端，轉(zhuǎn)錄方向相反，因此能通過(guò)氫鍵配對(duì)與后者相互作用，阻止RNaseH加工RNAII，使其不能轉(zhuǎn)化為有活性的引物，阻礙復(fù)制起始。沒(méi)有Rop蛋白，RNAI基因就不能起始轉(zhuǎn)錄。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)3、pBR322質(zhì)粒載體由三個(gè)不同來(lái)源的部分組成的：第一部分來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）。優(yōu)點(diǎn)是具有較小的分子量(4363bp)，易于純化。即使攜帶了6-8kb的外源DNA片段，操作仍較便利。有兩種抗生素抗性基因作為轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞可累積1000~3000個(gè)拷貝，便于制備重組體DNA。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)4、pUC質(zhì)粒載體（包括四個(gè)部分）：來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）氨芐青霉素抗性基因（ampr）大腸桿菌β-半乳糖酶基因（lacZ）啟動(dòng)子及編碼α-肽鏈的DNA序列。特稱(chēng)為lacZ’基因位于lacZ’基因5’-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS），外源基因插入破壞lacZ’基因功能優(yōu)點(diǎn)：更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建pUC質(zhì)粒載體時(shí)，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復(fù)制起點(diǎn)，其分子小了許多，pUC8為2750bp，pUC18為2686bp。由于缺失rop基因，pUC質(zhì)粒不經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)增時(shí)，平均每個(gè)細(xì)胞即可達(dá)500~700個(gè)拷貝。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)LacZ編碼β-半乳糖苷酶氨基端146個(gè)氨基酸的α-肽，IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)該基因表達(dá)，所合成的β-半乳糖苷酶α-肽與宿主細(xì)胞編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶，水解培養(yǎng)基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成藍(lán)色的溴氯吲哚。含X-gal培養(yǎng)基中非轉(zhuǎn)化菌落呈藍(lán)色，含有重組DNA分子的菌落為白色。pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來(lái)自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補(bǔ)作用。因此，可用X-gal顯色法實(shí)現(xiàn)對(duì)重組體轉(zhuǎn)化子的鑒定。具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8質(zhì)粒載體上。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5、pGEM-3Z質(zhì)粒長(zhǎng)度為2743bp，編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)lacZ'基因。含有兩個(gè)噬菌體啟動(dòng)子(T7和SP6)，為RNA聚合酶的附著提供了特異性識(shí)別位點(diǎn)。加入T7或SP6RNA聚合酶，所克隆的外源基因便會(huì)轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。6、穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector）由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。這類(lèi)質(zhì)粒載體可保證外源DNA序列在不同物種(原核和真核)的細(xì)胞間得到擴(kuò)增，用途廣泛。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)7、pBluescript噬菌粒載體pBluescript是一類(lèi)從pUC載體派生而來(lái)的噬菌粒載體，簡(jiǎn)稱(chēng)為pBS（+/-），如今則更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。SK表示多克隆位點(diǎn)區(qū)的取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI的方向轉(zhuǎn)錄；（+/-）表示單鏈?zhǔn)删wf1復(fù)制起點(diǎn)的兩種相反的取向。f1（+）起點(diǎn)表示當(dāng)pBluescript噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細(xì)胞時(shí)，能夠回收到lacZ基因的有意義鏈DNA；而f1（-）起點(diǎn)則表示當(dāng)pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細(xì)胞時(shí)，可回收到lacZ基因的無(wú)意義鏈DNA。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)(i)在多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）的兩側(cè)，存在一對(duì)T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子，用以定向指導(dǎo)插入在多克隆位點(diǎn)上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)；(ii)具有單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無(wú)輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復(fù)制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；(iii)編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標(biāo)記；(iv)含有一個(gè)lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學(xué)顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個(gè)整體5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。具備自主復(fù)制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成的雜種DNA分子后，還必須通過(guò)一個(gè)被稱(chēng)為細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過(guò)程將其重新導(dǎo)入到寄主細(xì)胞中，才能保證重組DNA分子的增殖。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5.2DNA基本操作技術(shù)1、核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來(lái)，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段。一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱(chēng)為多聚陰離子（polyanions），在電場(chǎng)中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個(gè)堿基對(duì)之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)2、細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖通過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法將體外構(gòu)建好的雜種DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。外源DNA通過(guò)自身載體上的復(fù)制起始點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制增殖，能在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期保存下來(lái)，并能以完整的形式從細(xì)胞中被分離純化出來(lái)。細(xì)菌轉(zhuǎn)化（transformation），是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自供體菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過(guò)程。圖：細(xì)菌轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)為提高效率，可對(duì)受體菌進(jìn)行物理或化學(xué)處理，增加其獲取DNA的能力。經(jīng)過(guò)這種處理的細(xì)胞被稱(chēng)作感受態(tài)細(xì)胞（competentcells）。CaCl2法將快速生長(zhǎng)期大腸桿菌置于經(jīng)0℃預(yù)處理的低滲CaCl2溶液中，細(xì)胞膨脹，膜通透性改變，易與外源DNA相粘附。將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激，外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞置于選擇性培養(yǎng)基上，篩選陽(yáng)性克隆。轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到5×106~2×107個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg超螺旋質(zhì)粒DNA。電擊法電脈沖可以在細(xì)胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。隨著跨膜電壓增加，大疏水性孔洞會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性孔洞，介質(zhì)中的DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期的E.coli菌液冷卻至4℃后離心，洗菌后用10%的甘油懸浮，將高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的電極杯中進(jìn)行電擊。獲得最大轉(zhuǎn)化效率時(shí)場(chǎng)強(qiáng)一般為12.5~15kV/cm，時(shí)間跨度一般為4.5~5.5毫秒。電擊轉(zhuǎn)化與溫度有關(guān)，一般在0~4℃進(jìn)行。由于轉(zhuǎn)化載體上常帶有LacZ基因，多用帶有不同抗生素的選擇性培養(yǎng)基結(jié)合α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選法鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是快速擴(kuò)增DNA序列最常用的方法。PCR反應(yīng)的模板DNA若是基因組上的某個(gè)片段，就稱(chēng)為genomicPCR，若是mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA，就稱(chēng)為RT-PCR。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)PCR的故事凱利·穆利斯（KaryMullis），1944年出生，1962年在佐治亞理工學(xué)院化學(xué)工程專(zhuān)業(yè)畢業(yè)。受同學(xué)們的蠱惑，1966年報(bào)考加州伯克利大學(xué)生化專(zhuān)業(yè)研究生被錄取。1968年一個(gè)人在《Nature》發(fā)表“時(shí)間反演的宇宙學(xué)意義”論文并僥幸通過(guò)了博士生資格考試。1972年，以“微生物鐵轉(zhuǎn)運(yùn)因子的結(jié)構(gòu)與有機(jī)合成”獲得博士學(xué)位。畢業(yè)后，嘗試寫(xiě)小說(shuō)，但因“不能使一部分人物具有不幸的遭遇”而失敗，又因厭惡天天宰殺實(shí)驗(yàn)小鼠而兩次丟掉工作。他有一條可能引起不少同學(xué)共鳴的學(xué)習(xí)曲線：剛開(kāi)始時(shí)，對(duì)拓寬自身知識(shí)面表現(xiàn)出極大的興趣—知識(shí)迅速上升，然后徘徊不前，最終進(jìn)入失望和不安階段—辭職。以后去一家小咖啡館當(dāng)了兩年經(jīng)理。1979年加入西特斯公司，負(fù)責(zé)DNA合成。正是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的DNA合成（單引物，以算術(shù)級(jí)數(shù)增長(zhǎng)），激發(fā)了他的思維。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)1983年8月，穆利斯第一次在公司正式作了一個(gè)有關(guān)PCR原理的學(xué)術(shù)報(bào)告。人們對(duì)這個(gè)報(bào)告的反應(yīng)冷談，只有少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員有些興趣。穆利斯回憶說(shuō)，“絕大多數(shù)人要么在我結(jié)束報(bào)告之前就離開(kāi)了會(huì)場(chǎng)，要么故意留下來(lái)給我出難題。他們認(rèn)為這些肯定是胡說(shuō)八道。”普遍的觀點(diǎn)是，雖然我不夠聰明，沒(méi)看出問(wèn)題的要害所在，但肯定有理由證明這個(gè)方法不行，要不為什么從前沒(méi)人想到呢？《SCIENCE》在1985年發(fā)表了第一篇關(guān)于PCR的論文。1993年，穆利斯由于發(fā)明了PCR獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)PCR技術(shù)的原理首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點(diǎn)的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸和實(shí)驗(yàn)中提供的引物序列合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。DNA解鏈（變性）引物與模板DNA相結(jié)合（退火）DNA合成（鏈的延伸）三步。經(jīng)不斷重復(fù)循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應(yīng)是2n,實(shí)得1.8n。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反應(yīng)混合物放置在高溫（>94℃）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。降低反應(yīng)溫度（退火，約50℃），約1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補(bǔ)序列位置上。將反應(yīng)混合物的溫度上升到72℃左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補(bǔ)鏈。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)常規(guī)PCR技術(shù)能擴(kuò)增兩引物之間的DNA區(qū)段，然而，有時(shí)我們也希望擴(kuò)增位于靶DNA區(qū)段之外的未知DNA序列，這就需要應(yīng)用反向PCR（reversePCR）技術(shù)。用一種在靶序列上沒(méi)有酶切位點(diǎn)的核酸限制性內(nèi)切酶消化DNA；產(chǎn)生大小不同的線性DNA片段群體，其中靶DNA區(qū)段的DNA分子長(zhǎng)度不超過(guò)2~3kb，經(jīng)連接后重新環(huán)化；按靶序列設(shè)計(jì)的一對(duì)引物與互補(bǔ)序列退火結(jié)合，其延伸方向如箭頭所指；左圖為反向PCR的基本操作程序。波紋線表示靶DNA區(qū)段，箭頭表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，分別用方框表示靶DNA區(qū)段的左側(cè)和右側(cè)序列。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)4、實(shí)時(shí)定量PCR（realtimequantitativePCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高，擴(kuò)增產(chǎn)物總量變異系數(shù)大，定量不準(zhǔn)確。90年代末期出現(xiàn)了Q-PCR，利用熒光檢測(cè)PCR儀繪制DNA擴(kuò)增過(guò)程中的累積速率動(dòng)態(tài)變化圖，基本消除在測(cè)定終端產(chǎn)物豐度時(shí)變異系數(shù)較大的問(wèn)題?；旌显赑CR反應(yīng)液中的熒光探針只有與大片段DNA結(jié)合后，才能夠被激發(fā)出熒光。隨著新合成DNA片段的增加，由于結(jié)合到DNA上的熒光探針增加，被激發(fā)產(chǎn)生的熒光相應(yīng)增加。非序列特異性熒光染料SYBRGreenI,激發(fā)光波長(zhǎng)520nm。左圖為SYBRGreenI作探針的實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程圖示5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度首次超過(guò)設(shè)定閾值時(shí)，PCR反應(yīng)所需的循環(huán)數(shù)。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以確定樣品中待檢測(cè)靶DNA的絕對(duì)含量。下圖為用實(shí)時(shí)定量PCR法分析未知樣品靶基因的絕對(duì)表達(dá)量。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)為確保熒光檢測(cè)的確實(shí)是靶DNA，又設(shè)計(jì)了僅能與目的DNA特異結(jié)合的熒光探針。TaqMan探針是一段與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA，長(zhǎng)50bp-150bp，該DNA的5’和3’端帶有短波長(zhǎng)和長(zhǎng)波長(zhǎng)兩個(gè)不同熒光基團(tuán)，由于彼此距離靠近，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）作用下發(fā)生熒光淬滅，因而檢測(cè)不到熒光。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，TaqMan探針結(jié)合到目的DNA序列上，并且會(huì)被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐個(gè)切除而降解。切下來(lái)的熒光基團(tuán)解除了熒光淬滅的束縛，會(huì)在激發(fā)光下發(fā)出熒光，因此，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度直接反映了所擴(kuò)增靶DNA的總量。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5、基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建把某種生物的基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載體組合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克隆（理論上每個(gè)序列至少有一個(gè)代表），這樣的克隆片段的總匯，稱(chēng)為基因組DNA文庫(kù)。構(gòu)建基因組文庫(kù)最常用的是λ噬菌體載體（克隆能力約15-20kb）和限制性內(nèi)切酶部分消化法。例如用識(shí)別4個(gè)核苷酸的核酸限制性內(nèi)切酶Sau3A，與BamHI是一對(duì)同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切產(chǎn)生的DNA片段可插入到經(jīng)BamHI消化的λ噬菌體載體上。此外，還有很多大容量克隆載體，如柯斯質(zhì)粒、細(xì)菌人工染色體（BAC）、P1源人工染色體（PAC）、酵母人工染色體（YAC）等都可用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建。它們的優(yōu)點(diǎn)是可以插入更大片段DNA，但是穩(wěn)定性一般較差，在大量復(fù)制的過(guò)程中容易出現(xiàn)缺失現(xiàn)象。操作也相對(duì)較困難。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5.3RNA基本操作技術(shù)真核生物基因組DNA龐大，有大量重復(fù)序列，很難直接分離得到靶基因片段。而cDNA來(lái)自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，無(wú)冗余序列，通過(guò)篩選cDNA文庫(kù)，可較快地分離到相關(guān)基因。細(xì)胞中的總RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一個(gè)典型的動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μgRNA，其中：80%-85%為rRNA15%-20%為tRNA及sRNAmRNA約占總RNA的1%-5%rRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，特別是28S和18S特征性條帶是電泳鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。RNA的濃度和純度可以通過(guò)測(cè)定其OD260和OD280來(lái)判斷。OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之間，表示所提取的RNA純度較好，如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚污染，則OD260/OD280的比值將明顯低于1.8。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)PolyATtractmRNA的分離純化過(guò)程簡(jiǎn)圖5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)由于RNA分子敏感脆弱，在自然狀態(tài)下難以被擴(kuò)增，為了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般將其反轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的DNA雙螺旋（cDNA，complementaryDNA），再插入到可以自我復(fù)制的載體中。左圖為cDNA合成過(guò)程示意圖5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)定向cDNA合成及分子修飾因?yàn)榻^大多數(shù)大腸桿菌細(xì)胞都會(huì)切除帶有5'-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以實(shí)驗(yàn)中常選用mcrA-mcrB-菌株以防止cDNA被降解。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA的長(zhǎng)度一般在0.5-8kb之間，質(zhì)粒載體和噬菌體類(lèi)載體都能滿足要求。cDNA文庫(kù)常用Uni-zapXR（一種λ噬菌粒載體）做載體，它具備噬菌體的高效性和質(zhì)粒載體系統(tǒng)利用藍(lán)白斑篩選的便利，可容納0-10kbDNA插入片段，含有pBluescript載體的全部序列。重組后可通過(guò)體內(nèi)剪切反應(yīng)（InVivoExcision）將cDNA插入片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒系統(tǒng)中進(jìn)行篩選、克隆和序列分析?；蛭膸?kù)的篩選基因文庫(kù)的篩選是指通過(guò)某種特殊方法從基因文庫(kù)中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過(guò)程。篩選的方法有很多種，如核酸雜交法，PCR篩選法和免疫篩選法等。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)核酸雜交法：核酸雜交法以其廣泛的適用性和快速性成為基因文庫(kù)篩選中最常用的一種方法，用放射性標(biāo)記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。將待篩選菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，適當(dāng)溫育。同時(shí)保留原來(lái)的菌落平板作對(duì)照。取出已經(jīng)長(zhǎng)有菌落的膜，用堿液處理，使菌落發(fā)生裂解，DNA隨之變性。用蛋白酶K處理硝酸纖維素膜去除蛋白質(zhì)，形成菌落DNA的印跡。80℃烘烤濾膜，將DNA固定在膜上。將濾膜與放射性標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交，通過(guò)放射性自顯影顯示雜交結(jié)果。通過(guò)對(duì)應(yīng)于平板上的位置找到相應(yīng)克隆。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)PCR篩選法將整個(gè)文庫(kù)（以質(zhì)粒的形式或者細(xì)菌的形式均可）保存在多孔培養(yǎng)板上，用設(shè)計(jì)好的目的基因探針對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行PCR篩選，鑒定出陽(yáng)性的孔，把每個(gè)陽(yáng)性孔中的克隆再稀釋到次級(jí)多孔板中進(jìn)行PCR篩選。重復(fù)以上程序，直到鑒定出與目的基因?qū)?yīng)的單個(gè)克隆為止。免疫篩選法該法僅適用于對(duì)表達(dá)文庫(kù)的篩選。若實(shí)驗(yàn)中靶基因的序列完全未知但是有針對(duì)該基因產(chǎn)物的特異性抗體，就可以采用免疫篩選法。左圖為噬菌體表達(dá)文庫(kù)的免疫化學(xué)篩選法示意圖5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5.4SNP的理論和應(yīng)用第11章再講！5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5.5基因克?。╟lone）技術(shù)在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個(gè)或數(shù)個(gè)個(gè)體組成的群體。從同一受精卵分裂而來(lái)的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。在細(xì)胞水平上，克隆一詞是指由同一個(gè)祖細(xì)胞（progenitorcell）分裂而來(lái)的一群帶有完全相同遺傳物質(zhì)的子細(xì)胞。在分子生物學(xué)上，人們把將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復(fù)制這種過(guò)程稱(chēng)為克隆。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)1、RACE技術(shù)（rapidamplificationofcDNAends）在已知cDNA序列基礎(chǔ)上克隆5’或3’端缺失序列的技術(shù)。根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)基因片段內(nèi)部特異引物，由該片段向外側(cè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的序列。用于擴(kuò)增5’端的方法稱(chēng)為5’RACE，用于擴(kuò)增3’端的稱(chēng)為3’RACE。5’RACE在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以基因片段內(nèi)部特異性引物（GSP1）啟始cDNA第一條鏈合成。RNase降解模板鏈mRNA，純化第一鏈。用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈3’端加入連續(xù)的dCTP。以連有oligo(dG)的錨定引物和基因片段內(nèi)部特異的nested引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段，用nestPCR檢測(cè)。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)3’RACE1、用oligo(dT)錨定引物啟始cDNA第一鏈的合成。2、降解模板mRNA。3、用通用錨定引物和基因片段內(nèi)部特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的3’片段，用nestPCR法檢測(cè)。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)2、cDNA差示分析法(RDA,RepresentationDifferenceAnalysis)通過(guò)降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片段。因?yàn)門(mén)ester和Driver在接受差示分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理，形成平均長(zhǎng)度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。每次T減D反應(yīng)后僅設(shè)置72℃復(fù)性與延伸，94℃變性這兩個(gè)參數(shù)共20個(gè)PCR循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度高。5分子生物學(xué)研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)3、Gatewa