《快速監(jiān)測度洛西汀血藥濃度的方法》

ICS11.120.10

CCSC10

CI

中國國際科技促進會團體標準

T/CIXXXX—2023

快速監(jiān)測度洛西汀血藥濃度的方法

Amethodforrapidmonitoringofduloxetinebloodconcentration

（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關專利連同支持性文件一并附上。

2023-XX-XX發(fā)布2023-XX-XX實施

中國國際科技促進會??發(fā)布

T/CIXXXX—2023

快速監(jiān)測度洛西汀血藥濃度的方法

1范圍

本文件提供了快速監(jiān)測度洛西汀血藥濃度的方法，該方法采用二維色譜儀系統(tǒng)，包括制備溶液、設

置色譜參數(shù)、實施檢測以及計算含量。

本文件適用于快速監(jiān)測度洛西汀血藥濃度的方法。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4技術方案

一種快速監(jiān)測度洛西汀血藥濃度的方法，采用二維液相色譜儀系統(tǒng)，二維液相色譜儀系統(tǒng)為PM3000

系統(tǒng)，包括帶在線脫氣單元的雙三元梯度泵、自動進樣器、輔助泵、帶有一個六通閥的柱溫箱和檢測器

DAD。

制備溶液

制備溶液的方法比較靈活，在這里不做限定。

蛋白沉淀劑為硫酸鋅溶液溶液和乙腈的混合物，其中硫酸鋅純度不低于98%，可市售獲得。硫酸鋅

溶液的質(zhì)量濃度為3%~5%,硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：（1~10）。

4.1.1空白血漿溶液

取正常人空白血漿2mL，加入蛋白沉淀劑稀釋定容至10mL，混合后超聲5min，將上述溶液轉(zhuǎn)移至

EP管中，于離心機中以10000rpm離心10min，取其上清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過濾，得到的濾液

作為空白血漿溶液。

4.1.2系統(tǒng)適用性溶液

取鹽酸度洛西汀對照品51.64mg（相當于度洛西汀46mg），精密稱定，加入甲醇溶解，定容至100

mL，得到濃度為0.46mg/mL的度洛西汀儲備液；精密量取度洛西汀儲備液1mL至10mL的容量瓶中，用

甲醇稀釋定容，得到濃度為46μg/ml的度洛西汀標準溶液。取10μL46μg/ml的度洛西汀標準溶液于

10mL的容量瓶中，加入空白血漿2mL，加入蛋白沉淀劑稀釋定容至10mL，混合后超聲5min，得到每1

mL中含46ng的度洛西汀溶液，將上述溶液轉(zhuǎn)移至EP管中，于離心機中以10000rpm離心10min，取其上

清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過濾，得到的濾液作為系統(tǒng)適用性溶液。

4.1.3標準曲線溶液

將上述46μg/ml的度洛西汀標準溶液稀釋500倍，得92ng/mL的線性儲備液，采用倍比稀釋法逐級

稀釋得到不同濃度的度洛西汀工作溶液，分別精密量取上述度洛西汀線性儲備液各5mL至10mL、4mL

至10mL、3mL至10mL、2mL至10mL、2.5mL至50mL容量瓶中，每個瓶中加入空白血漿2mL，加入

蛋白沉淀劑稀釋定容，混合后超聲5min，將上述溶液分別轉(zhuǎn)移至EP管中，于離心機中以10000rpm離心

10min，取其上清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過濾，分別得到濃度為46ng/mL、36.8ng/mL、27.6ng/mL、

18.4ng/mL、4.6ng/mL作為標準曲線溶液，按照上述46μg/ml的度洛西汀標準溶液的配制方法，另外

配制一份27.6ng/mL的度洛西汀標準品溶液作為含量測定溶液，用來按照外標法計算樣品中度洛西汀的

濃度。

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4.1.4供試品溶液

取正在進行鹽酸度洛西汀治療的患者的人體血漿2mL至10mL的容量瓶中，加入蛋白沉淀劑混勻并

稀釋定容，混合后超聲5min，將上述溶液轉(zhuǎn)移至EP管中，于離心機中以10000rpm離心10min，取其上

清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過濾，得到的濾液作為供試品溶液。

設置色譜參數(shù)

在二維液相色譜儀系統(tǒng)系統(tǒng)上設置一維柱色譜條件的參數(shù)、二維柱色譜條件的參數(shù)和大體積進樣條

件的參數(shù)和閥切換條件的參數(shù)，并使用空白血漿溶液和系統(tǒng)適用性溶液確認，待二維液相色譜儀系統(tǒng)系

統(tǒng)的壓力和基線平衡穩(wěn)定后，注入不少于5針空白血漿溶液和系統(tǒng)適用性溶液用來確認。

實驗用的二維液相色譜儀系統(tǒng)為PM3000系統(tǒng)，包括帶在線脫氣單元的雙三元梯度泵、自動進樣器、

輔助泵、帶有一個六通閥的柱溫箱和檢測器，上述雙三元梯度泵包括一維泵和二維泵，一維泵用于在線

固相萃取，二維泵用于色譜分析，吸附在一維柱的度洛西汀通過六通閥切換到分析流路中，可以將原來

用4~5h進行固相萃取前處理的樣品縮短至3min左右在線完成，凈化和濃縮后的度洛西汀樣品直接進行定

量分析。上述六通閥設置的閥口位置順序為閥1、閥2、閥3、閥4、閥5和閥6。

如圖1，一維柱色譜條件和二維柱色譜條件通過閥切換技術的系統(tǒng)配合的工作原理如下：

a)一維洗脫液通過一維泵由閥2接口進入，閥2接口切換經(jīng)閥1接口，經(jīng)與閥1和閥4通過管

線相連的一維柱實現(xiàn)待測物的富集濃縮，多余的一維洗脫液，由閥4接口切換經(jīng)閥3接口至

閥3接口經(jīng)管線排出；

b)富集的餾分待測物由閥4接口切換經(jīng)閥5接口，二維洗脫液通過二維泵由閥6接口進入，閥6

接口切換經(jīng)閥1接口，使得一維柱以正向模式與二維柱串聯(lián)，乙腈-0.05mmol磷酸二氫鉀

（PH=6.0）緩沖液作為洗脫液將餾分待測物從一維柱上洗脫下來，經(jīng)管線由閥5接口進入二

維柱進行進一步分離，分離的待測物經(jīng)所述檢測器檢測后由管線排出，檢測器通過信號傳輸

轉(zhuǎn)化在計算機上顯示出相應的色譜圖。

圖1

在上述PM3000系統(tǒng)中的自動進樣器的最大進樣體積為1000μL，可以連續(xù)進樣富集待測物質(zhì)，通常

對于一維HPLC而言進樣體積過大會嚴重導致色譜峰擴展而影響分離度進而降低靈敏度，設計了通過大體

積進樣來提高本方法的靈敏度。

大體積的樣品先流經(jīng)一維柱富集在柱頂端，然后再經(jīng)過一維洗脫液洗脫血漿樣品中的大分子蛋白成

分和其他雜質(zhì)，通過正向切閥流入到二維柱中進行分離和定量分析。由于樣品溶劑中含有高比例的有機

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溶劑，所以用了大體積泵進水稀釋，確保被測物質(zhì)在一維柱上富集不流出，由于進樣體積較大，容易導

致色譜峰擴展及變形，采用一維柱富集純化后洗脫液正方向切閥，進行洗脫后再流經(jīng)至二維柱，并設計

了輔助泵在一維柱富集純化期間注入純化水，使一維柱中的待測成分充分保留，這樣就可實現(xiàn)大體積進

樣也不會使色譜峰峰型變寬。而且，輔助泵注入純水的程序為：0-3min，流速為1.2mL/min；3-3.1min，

流速由1.2mL/min改變?yōu)?.1mL/min；3.1-14.5min，流速為0.1mL/min；14.5-14.8min，流速由0.1

mL/min改變?yōu)?.2mL/min；14.8-15.0min，流速為1.2mL/min。

為了能夠在短時間（3分鐘內(nèi)）純化富集血漿中的有效成分，對一維柱的填充劑材料基質(zhì)要求有很

好的親水性，因為血漿中含有血細胞和大分子的蛋白，這就需要色譜純化分離有分子排阻和色譜分配兩

種模式同時存在，并結(jié)合度洛西汀與填充劑材料的相互作用，在本實施例中，具體的一維柱為NNJW16851

Cat.No.12439MFPh-1S-5固相萃取柱，規(guī)格為4.0mml.D.×20mm，針對度洛西汀的化合物結(jié)構，對二

維柱的填充劑材料基質(zhì)的表面要求有很好的親水性，二維柱的雙封端技術優(yōu)良，依據(jù)度洛西汀在二維柱

中的熱力學和動力學特點，使得度洛西汀具有較好的分離度，可以選擇填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠

的色譜柱，具體的二維柱為Unisil3-120C18UltraQCS180425色譜柱，規(guī)格為SS4.6mm×100mm，其填

料中硅醇基活性極低，該色譜柱具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和耐用性，使用壽命達1000針次以上。

進一步的，在二維液相色譜儀系統(tǒng)上設置的色譜參數(shù)應符合表1。

表1色譜參數(shù)

儀器PM3000系統(tǒng)為一體機其中包括：泵、輔助泵、自動進樣器、柱溫箱、檢測器DAD

檢測器DAD檢測器

檢測波長290nm

一維柱NNJW16851Cat.No.12439MFPh-1S-5（4.0mml.D.×20mm）

二維柱Unisil3-120C18UltraQCS180425色譜柱（SS4.6mm×100mm）

一維洗脫液一維流動相A：甲醇；一維流動相B：水

二維洗脫液二維流動相A：乙腈；二維流動相B：0.05mmol磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)PH=6.0

時間/min流速/mL·min-1A%B%

00.51090

6.50.51090

7.01.58020

一維洗脫方式：梯度洗脫程序9.01.58020

9.21.51090

11.01.51090

11.50.51090

15.00.51090

時間/min流速/mL·min-1A%B%

01.0005149

二維洗脫方式：等度洗脫程序

151.0005149

NOTimeValveleft

10.11-2

閥切換程序

23.01-6

36.51-2

柱溫30℃

進樣量1000μl

為了核實二維液相色譜儀系統(tǒng)具有良好的分離度和精確度，以勝任將要實施的檢測工作，在進樣空

白血漿溶液后，重復進樣系統(tǒng)適用性溶液并將所測結(jié)果與本文件中的要求進行比較，如果符合，后續(xù)的

供試品檢測分析則可以繼續(xù)進行。在本實施例中，對系統(tǒng)適用性溶液的要求為空白血漿溶液的色譜圖中

不能有度洛西汀峰的干擾峰，系統(tǒng)適用性溶液中的度洛西汀色譜峰與其他物質(zhì)色譜峰的分離度不小于

1.5，度洛西汀峰純度閾值不小于0.990，重復進樣5針度洛西汀峰峰面積的相對標準偏差(RSD)應不得過

1%。

實施檢測

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4.6ng/mL、18.4ng/mL、27.6ng/mL、36.8ng/mL、46.0ng/mL的標準曲線溶液和供試品溶液分

別注入所述二維液相色譜儀，各進樣1針，記錄色譜圖時間15分鐘。

計算含量

分析得到所有標準曲線溶液對應的度洛西汀的峰面積，將上述結(jié)果通過加權最小二乘法進行線性回

歸，得到度洛西汀的標準曲線；標準曲線的方程為y=ax+b，其中，y為標準曲線溶液對應的度洛西汀的

峰面積，x為標準曲線溶液中度洛西汀的濃度，得到的線性方程為：y=0.063x-0.0099，線性相關系數(shù)

r=0.9999。

在上述的標準曲線線性范圍內(nèi)，按外標法計算得到供試品溶液中度洛西汀的含量。

計算公式為：

血漿樣品中度洛西汀的濃度=供試品中度洛西汀的峰面積*度洛西汀標準品濃度*稀釋倍數(shù)/度洛西

汀標準品峰面積。

考察了不同配比、不同濃度硫酸鋅溶液的蛋白質(zhì)沉淀劑對方法檢測結(jié)果的影響：

a)試驗組1，0.3%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

b)試驗組2，0.4%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

c)試驗組3，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

d)試驗組4，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：1；

e)試驗組5，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

f)試驗組6，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：4；

g)試驗組7，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：6；

h)試驗組8，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：8；

i)對比例1，0.2%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

j)對比例2，0.6%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

k)對比例3，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為2：1；

l)對比例4，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：11；

m)對比例5，乙腈1000μL；考察回收率，結(jié)果應符合表2。

表2不同配比的蛋白沉淀劑對方法回收率的影響

項目試驗組1試驗組2試驗組3試驗組4試驗組5

回收率96.9%97.3%97.8%104.7%95.6%

項目試驗組6試驗組7試驗組8對比例1對比例2

回收率100.5%99.3%103.2%95.1%95.5%

項目對比例3對比例4對比例5

回收率92.9%94.3%93.4%

由表2可知，試驗組1～試驗組8提供的蛋白沉淀劑可保證本發(fā)明的方法回收率在95%～105%之間，采

用0.5%的硫酸鋅溶液，與乙腈的體積比在1：4～1：6范圍內(nèi)時，可保證本發(fā)明的方法回收率在98%～102%

之間。

考察了超聲時間對方法回收率的影響，超聲時間不能少于3min，在超聲的作用下，硫酸鋅水溶液

的溶劑化作用更有利于血漿中度洛西汀的提取，乙腈可以更好的輔助將蛋白沉淀下來，時間過短不利于

度洛西汀的提取，導致方法回收率偏低，不準確，為了獲得準確度更高和操作方便，選擇超聲時間5min。

如圖2-3所示，系統(tǒng)適用性測試實驗，結(jié)果為空白血漿溶液的色譜圖中沒有出現(xiàn)度洛西汀干擾峰，

系統(tǒng)適用性溶液的色譜圖中與度洛西汀峰最近的雜質(zhì)峰的分離度為2.0，大于1.5，符合本方法的要求，

從而驗證了本方法專屬性強。