T-JAASS 144-2024 土壤微生物胞外酶活性測定熒光法

ICS65.020.99JAASSDeterminationofsoilmicrobialextracellularenzymeactivityFluorescencemethodIT/JAASS144—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4原理 25土壤采集和試劑配制 26實(shí)驗(yàn)儀器 37具體操作 38結(jié)果計(jì)算 4附錄A（資料性）MUB或AMC標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 5T/JAASS144—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省農(nóng)學(xué)會提出并歸口。本文件起草單位：寧波大學(xué)、寧波市鄞州區(qū)農(nóng)技推廣站、中國科學(xué)院南京土壤研究所、寧波（北侖）中科海西產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心。本文件主要起草人：祝貞科、葛體達(dá)、王先挺、張廣斌、李剛、劉瓊、張昊青、魏亮。1T/JAASS144—2024土壤微生物胞外酶活性測定熒光法本文件描述了土壤微生物胞外酶活性利用微孔熒光法的測定方法。本文件適用于使用微孔熒光法檢測土壤中與碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)的關(guān)鍵水解酶活性，且酶底物熒光指示劑需是4-甲基傘形酮或7-氨基-4-甲基香豆素。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。CB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備GB7172土壤水分測定法GB/T32722土壤質(zhì)量土壤樣品長期和短期保存指南GB/T36197土壤質(zhì)量土壤采樣技術(shù)指南HJ613土壤干物質(zhì)和水分的測定重量法T/GSSF004土壤樣品采集、制備及保存技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1β-1.4-葡萄糖苷酶β-1.4-Glucosidase：BG是一種碳降解酶，在碳循環(huán)過程中降解β-1.4-葡聚糖和纖維素，將纖維二糖水解為葡萄糖。3.2是一種碳降解酶，碳循環(huán)過程中水解低聚木糖生成木糖。3.3纖維二糖葡萄糖苷酶B-D-cellobioside：CBH是一種碳降解酶，碳循環(huán)過程中從纖維素分子的非還原端水解纖維二糖二聚體。3.4β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶β-N-acetylglucosaminidase：NAG是一種氮降解酶，氮循環(huán)過程中在幾丁質(zhì)和其他β-1.4-連接的氨基葡萄糖聚合物的降解中發(fā)揮作3.5亮氨酸氨基肽酶Leucineaminopeptidase：LAP是一種氮降解酶，氮循環(huán)過程中從多肽的N端水解亮氨酸和其他疏水性氨基酸。3.6磷酸酶Acidphosphatase：PHOS是一種磷降解酶，磷循環(huán)過程中水解磷酸單酯或磷酸二酯，釋放出磷酸。3.74-甲基傘形酮4-Methylumbelliferone：MUB是一種水溶性的強(qiáng)熒光染料，在測定過程中，通過酶的催化作用，標(biāo)記有傘形酮的底物發(fā)生分子內(nèi)消除反應(yīng)，導(dǎo)致傘形酮脫落，形成與原底物具有不同的光學(xué)特征的產(chǎn)物。目前廣泛使用的底物有4-甲基傘型酮β-1.4-葡萄糖苷(4-MUB-β-D-glucoside)、4-甲基傘型酮β-木糖苷（4-MUB-β-Xylosidase）、2T/JAASS144—20244-甲基傘型酮纖維二糖苷(4-MUB-β-D-cellobioside)、4-甲基傘形酮乙酰氨基葡萄糖苷(4-MUB-β-N-acetylglucosaminidase)、4-甲基傘形酮磷酸酯(4-MUB-Phosphate)，分別是β-1.4-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、纖維二糖葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶、磷酸酶的熒光指示劑。3.87-氨基-4-甲基香豆素7-Amino-4-methylcoumarin：AMC是一種水溶性的強(qiáng)熒光染料，是亮氨酸氨基肽酶底物特有的熒光指示劑。4原理熒光酶測定使用來自底物熒光的差異來測量酶反應(yīng)。熒光是當(dāng)吸收不同波長的光后分子發(fā)出一個(gè)波長的光，其與特定底物結(jié)合時(shí)熒光特性消失，當(dāng)酶分解其特異性底物時(shí)，通過酶的水解作用，底物中包含的熒光物質(zhì)MUB或AMC被釋放出來，由于MUB和AMC在365nm波長處激發(fā)，在450nm處檢測到熒光，進(jìn)而設(shè)定365nm激發(fā)波長和450nm檢測波長，通過檢測其熒光量來表征酶活性。5土壤采集和試劑配制5.1土壤樣品采集及保存5.1.1樣品采集土壤樣品采集應(yīng)符合GB/T36197和T/GSSF004的規(guī)定。5.1.2樣品保存采集的樣品按照GB/T32722和T/GSSF004的規(guī)定4℃儲存，7天之內(nèi)測定。5.2試劑配制試劑應(yīng)按照GB/T603的規(guī)定進(jìn)行制備。5.2.1標(biāo)準(zhǔn)物——標(biāo)準(zhǔn)物1：MUB稱取17.5mgMUB溶于80mL無菌去離子水中，將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為1mmol/L?！獦?biāo)準(zhǔn)物2：AMC稱取17.5mgAMC溶于80mL無菌去離子水中，將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為1mmol/L。5.2.21MNaOH溶液稱取NaOH4.00g溶于80mL無菌去離子水中，將其轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，用無菌去離子水定容到100mL，濃度為1mol/L。5.2.3乙酸鈉緩沖液稱取乙酸鈉6.804g于1L燒杯中，加無菌去離子水至800mL，用冰醋酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至測定樣品的適宜值，再將其轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中，用無菌去離子水定容至1L，配制成濃度為50mmol/L。pH具體值需要根據(jù)采集土壤的pH分布及均值確定，調(diào)節(jié)至土壤最適pH。5.2.4Tris（三羥甲基氨基甲烷）緩沖液稱取6.057gTris堿溶于800mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中，用無菌去離子水定容至1L，用NaOH溶液調(diào)至適宜pH，配制成濃度為50mmol/L。5.2.5不同底物溶液3T/JAASS144—2024——BG酶底物：稱取6.77mg4-甲基傘型酮β-1.4-葡萄糖苷溶于80mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存?！猉YL酶底物：稱取6.17mgβ-木糖苷溶于80mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存?！狢BH酶底物：稱取0.01g4-甲基傘型酮纖維二糖苷溶于80mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存?！狽AG酶底物：稱取7.59mg4-甲基傘形酮乙酰氨基葡萄糖苷溶于80mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存?！狶AP酶底物：稱取6.5mgL-亮氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素溶于溶于0.5mL丙酮，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存?！狿HOS酶底物：稱取5.12mg4-甲基傘形酮磷酸酯溶于80mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存。5.3淬火標(biāo)準(zhǔn)曲線配制稀釋1mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)物溶液（MUB或AMC）配制淬火標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為0、2.5、5、10、25、50、100μmol/L（具體配制見附錄A）。6實(shí)驗(yàn)儀器電子天平，恒溫培養(yǎng)箱，加液器，磁力攪拌器，多功能酶標(biāo)儀。7具體操作7.1懸濁液制備堿性土壤緩沖液適用Tris緩沖液，酸性或中性土壤適用乙酸鈉緩沖液。稱取1.00g新鮮土壤，放在150mL容器中，加入125mL滅菌冷卻后的Tris緩沖液或乙酸鈉緩沖液，即為土壤懸濁液，封口加蓋，搖床180r/min震蕩2h。另根據(jù)HJ613和GB7172標(biāo)準(zhǔn)測定土壤含水率。7.2樣品添加7.2.1測定樣品、空白樣品、淬火樣品震蕩結(jié)束后將裝有懸濁液的容器放置在磁力攪拌器上，加入磁珠，一邊攪拌一邊加入200μL土壤懸濁液至96微孔板中，每一個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，吸取5份，隨后依次加入50μL5種不同的酶底物溶液，即為測定樣品；吸取200μL土壤懸濁液至96微孔板中，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，加入50μL緩沖液，即為空白樣品；再吸取200μL土壤懸濁液至96微孔板中，分別加入50μL不同濃度的MUB或AMC標(biāo)曲溶液，每一個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，即為淬火樣品。7.2.2標(biāo)準(zhǔn)樣品、陰性樣品最后另取一個(gè)96微孔板加入200μL緩沖液，再加入50μL不同濃度的MUB或AMC標(biāo)曲溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)點(diǎn)8個(gè)重復(fù)，即為標(biāo)準(zhǔn)樣品；再吸取200μL緩沖液，再加入50μL不同的酶底物溶液，即為陰性樣品。7.3樣品培養(yǎng)懸濁液和酶底物全部加入完成后，將96微孔板置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后在每個(gè)孔中加入10μL1M的NaOH溶液終止反應(yīng)。注：NaOH溶液不可提前注入等待上機(jī)，需注入一板立即測定一板4T/JAASS144—20247.4樣品測定用無菌紙擦凈酶標(biāo)板底部，去除凝結(jié)物防止影響讀數(shù)。在多功能酶標(biāo)儀上，設(shè)定激發(fā)波長365nm和檢測波長450nm，測定每孔的熒光值。8結(jié)果計(jì)算8.1土壤淬火曲線校正系數(shù)土壤中的某些成分如有機(jī)質(zhì)中的胡敏酸導(dǎo)致熒光類物質(zhì)的淬滅，在計(jì)算的過程中，通過引入校正系數(shù)，將被土壤淬滅的產(chǎn)生的熒光類物質(zhì)重新考慮進(jìn)來，MUB或AMC淬火標(biāo)準(zhǔn)曲線按公式（1）計(jì)算：式中：q——土壤淬火曲線校正系數(shù)；kh——土壤淬火樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；k——土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。8.2熒光釋放系數(shù)將讀取的熒光值換算為濃度(μmol）的換算系數(shù)，按公式（2）計(jì)算：式中：e——熒光釋放系數(shù)；kh——土壤淬火樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；Vh——土壤淬火樣品中每個(gè)孔加入MUB或AMC的體積（mL）。8.3校正后樣品熒光值經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線校正后的測定樣品孔熒光值，按公式（3）計(jì)算：F=(f-fb)/q-cs····················································(3)式中：F——校正后的樣品熒光值；f——酶標(biāo)儀讀取的測定樣品微孔熒光值；fb——酶標(biāo)儀讀取的空白樣品微孔熒光值；q——土壤淬火曲線校正系數(shù)；cs——酶標(biāo)儀讀取的陰性樣品微孔熒光值。8.4土壤酶活性最終所得的土壤樣品酶活性，按公式（4）計(jì)算：Ab=FV/(eV1tm)··················································(4)式中：Ab——土壤樣品酶活性(μmolg-