DB12T 647-2016 大白菜品種純度SSR分子標記檢測方法

B31DB12大白菜品種純度SSR分子標記檢測方法MethodsofidentifyingvarietalpurityofChinesecabbagebyusingSSR-basedmarkers天津市市場和質量監(jiān)督管理委員會發(fā)布本標準起草單位：天津市農業(yè)質量標準與檢測技術研究所、天津市蔬菜研究大白菜品種純度SSR分子標記檢測方法下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本GB/T3543.2農作物種子檢驗規(guī)程GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和品種純度指種子在SSR分子標記帶型方面典型一致的程度，用具有本品種特異帶型的種子粒數占檢測樣品種子粒數的百分率表示，以反映某品種特征特性的一致性聚合酶鏈式反應polymerasechainreac簡單重復序列simplesequencerep由幾個核苷酸（1-6個）為重復單位聚集而成的長達幾十個至幾百個bp（一般為100-200bp）的串聯重復序列，又稱微衛(wèi)星序列或短串聯重復序列，其高度多態(tài)性主要來源于串聯數目的不技術將多態(tài)的SSR擴增出來，通過電泳檢測擴增產物，利用電泳圖譜進行大白菜品種乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2三羥甲基氨基甲烷（Tris鹽酸（HCl，36%十二烷基硫酸鈉（SDS）；氯化鈉（NaCl）；氫氧化鈉（NaOH）；硼酸；去離子甲酰胺；溴酚藍；二甲苯青）；）；按照GB/T3543.2規(guī)定方法扦樣，從送檢樣品中隨機取10g種子，分別隨機取其親本種子在玻璃培養(yǎng)皿底部墊上一層厚度適宜的棉花，用自來水浸濕后均勻地撒上種子，再于表面取單株幼苗子葉，放入1.5mL離心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL離心管中。將DNA提取液預入500μL乙醇—乙酸銨溶液，60000.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。使用紫外-可以篩選出來的SSR分子標記為引物擴增送.................純度%=具有本×100%4A.1DNA提取液按照引物合成單的說明先配制100μmol/L的儲存液，取適量儲存液稀釋40倍，配制濃度為2.5mmol/L的使用液。A.36×變性上樣緩沖液Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDA.540%丙烯胺膠丙烯酰胺190g，甲叉雙丙烯酰胺10A.64.5%丙烯胺膠20μL親和硅烷，20μL冰醋酸，加無水乙醇至2mL?，F用現配。A.82%剝離硅烷0.1g過硫酸銨溶于1mL超純水中?，F用現配。F:CTTCCACAGGAGGAGAF:TCCCTCGTGACAAATCF:CAAAACTGATTGAAACF:AACGGATCTGACTTGGCR:ACCCACATAGCATGAG將玻璃板洗凈，用無水乙醇擦兩遍，晾干。在長板上涂1%親和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。操作過程中防止兩塊玻璃板互相污染。待玻璃板徹底干燥后，將生。灌膠結束后，將梳子齒向外，輕輕的插入膠中，使其聚合1h以上。待膠凝固后，拔出梳子，將電泳槽組裝好，80W恒功率下預電泳15min~在20μLPCR產物中加入4μL6×變用洗耳球吹洗加樣槽，清除氣泡和雜質。每個加樣孔加入5μL變性