DB12T 649-2016 甜瓜品種純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè)方法　　

B31DB12甜瓜品種純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè)方法MethodsofidentifyingvarietalpurityofmuskmelonbyusingSSR-basedmarkers天津市市場(chǎng)和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、天津市蔬菜研究甜瓜品種純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè)方法下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和品種純度指種子在SSR分子標(biāo)記帶型方面典型一致的程度，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測(cè)樣品種子粒數(shù)的百分率表示，以反映某品種特征特性的一致性由幾個(gè)核苷酸（1-6個(gè)）為重復(fù)單位聚集而成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)至幾百個(gè)bp（一般為100-200bp）的串聯(lián)重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星序列或短串聯(lián)重復(fù)序列，其高度多態(tài)性主要來(lái)源于串聯(lián)數(shù)目的不SSR分布于甜瓜整個(gè)基因組，每個(gè)位點(diǎn)上重復(fù)單位的數(shù)目不同造成了品種間的多態(tài)性，利用PCR技術(shù)將多態(tài)的SSR擴(kuò)增出來(lái)，通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，利用電泳圖譜進(jìn)行甜瓜品種純乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2三羥甲基氨基甲烷（Tris鹽酸（HCl，36%十二烷基硫酸鈉（SDS）；氯化鈉（NaCl）；氫氧化鈉（NaOH）；硼酸；去離子甲酰胺；溴酚藍(lán)；二甲苯青）；）；按照GB/T3543.2規(guī)定方法扦樣，從送檢樣品中隨機(jī)在玻璃培養(yǎng)皿底部墊上一層厚度適宜的棉花，用自來(lái)水浸濕后均勻地撒上種子，再于表取單株幼苗子葉，放入1.5mL離心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL離心管中。將DNA提取液預(yù)按照附錄C規(guī)定的方法，進(jìn)行4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳以篩選出來(lái)的SSR分子標(biāo)記為引物擴(kuò)增送.................純度%=具有本×100%4A.1DNA提取液按照引物合成單的說(shuō)明先配制100μmol/L的儲(chǔ)存液，取適量?jī)?chǔ)存液稀釋40倍，配制濃度為2.5mmol/L的使用液。A.36×變性上樣緩沖液Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDA.540%丙烯胺膠丙烯酰胺190g，甲叉雙丙烯酰胺10A.64.5%丙烯胺膠20μL親和硅烷，20μL冰醋酸，加無(wú)水乙醇至2mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。A.82%剝離硅烷0.1g過(guò)硫酸銨溶于1mL超純水中?，F(xiàn)用現(xiàn)配。6F:AAGAAAGTCCCTCAGTTCACF:AACAGGTAGAGGAAAGCF:ATCCAACTCGACCAAGAAAC7將玻璃板洗凈，用無(wú)水乙醇擦兩遍，晾干。在長(zhǎng)板上涂1%親和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。操作過(guò)程中防止兩塊玻璃板互相污染。待玻璃板徹底干燥后，將生。灌膠結(jié)束后，將梳子齒向外，輕輕的插入膠中，使其聚合1h以上。待膠凝固后，拔出梳子，將電泳槽組裝好，80W恒功率下預(yù)電泳15min~在20μLPCR產(chǎn)物中加入4μL6×變用洗耳球吹洗加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)。每個(gè)加樣孔加入5μL變性后的