《尿液中多環(huán)芳烴代謝物的測定 液液萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》

ICS13.020.30

CCSC52

GAIA

廣東省分析測試協(xié)會團體標準

T/GAIAXXX—2024

尿液中多環(huán)芳烴代謝物的測定

液液萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

Determinationofpolycyclicaromatichydrocarbonmetabolitesintheurinesamples

byliquidliquidextractionandultra-highperformanceliquidchromatography-tandem

massspectrometry

（征求意見稿）

（本草案完成時間：2024/02/20）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

2024-XX-XX發(fā)布2024-XX-XX實施

廣東省分析測試協(xié)會??發(fā)布

T/GAIA—XXXX

尿液中多環(huán)芳烴代謝物的測定

液液萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

1范圍

本標準規(guī)定了尿液中9種羥基多環(huán)芳烴的液液萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。

本標準適用于尿液中1-羥基萘、2-羥基萘、2-羥基芴、3-羥基芴、1-羥基菲、2-羥基菲、3-羥基菲、

4-羥基菲、1-羥基芘9種羥基多環(huán)芳烴的檢測，可用于尿液中羥基多環(huán)芳烴的檢測及內(nèi)暴露水平監(jiān)測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗用水規(guī)格和實驗方法

GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

尿液樣品中的羥基多環(huán)芳烴酶解后，用正己烷萃取，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，內(nèi)標法定量。

5試劑與材料

5.1試劑

5.1.1水：GB/T6682所規(guī)定的一級水。

5.1.2正己烷（C6H14）：質(zhì)譜純。

5.1.3乙腈（CH3CN）：質(zhì)譜純。

5.1.4甲醇（CH3OH）：質(zhì)譜純。

5.1.5異丙醇（C3H8O）：色譜純。

5.1.6乙酸（C2H4O2）：分析純。

5.1.7乙酸鈉（C2H3NaO2）：分析純。

5.1.8β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶：大于100000units/mL

5.2試劑配制

5.2.1乙腈-水溶液（2+8）：取20mL乙腈，加入100mL超純水，混勻。

5.2.2乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH=5.0）：稱取34.4g乙酸鈉，以適量純水溶解，加入4.4mL乙酸，用

純水定容至1000mL，用乙酸和氫氧化鈉溶液調(diào)pH至5.0。

5.2.3異丙醇-甲醇溶液（1+9）：取100mL異丙醇，加入900mL甲醇，混勻。

5.3標準品

5.3.1羥基多環(huán)芳烴：1-羥基萘、2-羥基萘、2-羥基芴、3-羥基芴、1-羥基菲、2-羥基菲、3-羥基菲、

4-羥基菲、1-羥基芘，純度≥99.0%，-18℃下避光保存。具體內(nèi)容見附錄A。

5.3.2內(nèi)標：1-羥基萘-D8、2-羥基萘-D8、3-羥基芴-D9、1-羥基菲-D9、2-羥基菲-D9、1-羥基芘-D9，純

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度≥99.0%，-18℃下避光保存。具體內(nèi)容見附錄A。

5.4標準溶液制備

5.4.1標準儲備液（100μg/mL）：取適量的1-羥基萘、2-羥基萘、2-羥基芴、3-羥基芴、1-羥基菲、

2-羥基菲、3-羥基菲、4-羥基菲、1-羥基芘標準物質(zhì)，精密稱定，用乙腈配制成濃度為100μg/mL的

單標標準儲備液，-18℃下避光保存，保存期6個月。

5.4.2混合標準中間液（1.0μg/mL）：吸取適量各標準儲備液（5.4.1），用乙腈配制成濃度為1.0

μg/mL的混合標準中間液，-18℃下避光保存，保存期3個月。

5.4.3混合標準使用液（100μg/L）：吸取適量混合標準中間液（5.4.2），用乙腈配制成濃度為100

μg/L的混合標準使用液，-18℃下避光保存，保存期1個月。

5.4.4內(nèi)標儲備液（100μg/mL）：取適量的1-羥基萘-D8、2-羥基萘-D8、3-羥基芴-D9、1-羥基菲-D9、

2-羥基菲-D9、1-羥基芘-D9內(nèi)標標準物質(zhì)，精密稱定，用乙腈配制成濃度為100μg/mL的內(nèi)標單標標

準儲備溶液，-18℃下避光保存，保存期6個月。

5.4.5混合內(nèi)標中間液（1.0μg/mL）：吸取適量內(nèi)標單標儲備液（5.4.4），用乙腈配制成濃度為

1.0μg/mL的混合內(nèi)標標準中間液，-18℃下避光保存，保存期3個月。

5.4.6混合內(nèi)標使用液（100μg/L）：吸取適量混合內(nèi)標中間液（5.4.5），用乙腈配制成濃度為100

μg/L的混合內(nèi)標標準使用液，-18℃下避光保存，保存期1個月。

5.4.7混合內(nèi)標使用液（10μg/L）：吸取適量混合內(nèi)標中間液（5.4.5），用乙腈配制成濃度為10μ

g/L的混合內(nèi)標標準使用液，-18℃下避光保存，保存期1個月。

5.4.8標準工作液：吸取適量的混合標準使用液（5.4.3）和混合內(nèi)標使用液（5.4.6），用乙腈-水溶

液（2+8）配成濃度為0.10μg/L、0.20μg/L、0.50μg/L、1.00μg/L、2.00μg/L、5.00μg/L、

10.0μg/L的系列標準工作液，內(nèi)標濃度為2.0μg/L，當天配制。

6儀器和設(shè)備

6.1超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。

6.2分析天平：感量0.01g和0.00001g。

6.3離心機：5000r/min。

6.4渦旋震蕩器：3000r/min。

6.5氮吹濃縮儀。

6.6恒溫振蕩器。

6.7精密移液器。

7試樣的制備與保存

7.1試樣的制備

取適量新鮮或解凍的空白或供試尿樣，混合均勻。

a)取混勻后的供試樣品，作為供試試樣；

b)取混勻后的空白樣品，作為空白試樣。

在處理樣本時，應嚴格遵從對潛在生物傳染性樣本處理的相關(guān)規(guī)定，使用時遵循生物安全規(guī)則，并

根據(jù)規(guī)定對廢物進行處理。

7.2樣本用量

一般用量為0.5mL～2.0mL，為保證取樣的準確性和操作可行性，最小取樣量不宜低于0.5mL。

7.3試料的保存

-70℃以下保存，不可反復凍融。

8分析步驟

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8.1提取

準確移取試樣1.0mL，置于15mL離心管中，加入1.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH=5.0），渦旋混勻，

加入β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶20μL，渦旋混勻，37℃恒溫水浴酶解16h。冷卻至室溫，加入

濃度為10μg/L混合內(nèi)標使用液40μL，渦旋混勻。加入3mL正己烷，3000r/min渦旋30s，2000r/min

振蕩10min，3000r/min振蕩10min，5000r/min離心10min，取上層有機層，下層液體加入3mL正己

烷，重復上述操作2次，合并有機層，室溫氮吹至近干。加入200μL的乙腈-水溶液（2+8），渦旋30s

復溶，供上機測定。

9測定

9.1.1液相色譜參考條件

a)色譜柱：CORTECSC18色譜柱（100mm×4.6mm，2.7μm），或相當者；

b)柱溫：27℃；

c)進樣量：5μL；

d)流速：0.3mL/min；

e)流動相：A為水，B為異丙醇-甲醇溶液（1+9），梯度洗脫條件見表1。

表1液相色譜梯度洗脫條件

時間（min）A（%）B（%）

065.035.0

2.0065.035.0

15.050.050.0

25.00.0100.0

29.00.0100.0

30.065.035.0

38.065.035.0

9.1.2質(zhì)譜儀參考條件

a)離子源：電噴霧離子源（ESI）；

b)掃描方式：負離子掃描；

c)檢測方式：多反應離子監(jiān)測（MRM）；

d)毛細管電壓：2.5kv；去溶劑化溫度：500℃；

e)霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣由氮氣發(fā)生器產(chǎn)生或使用高純氮氣、碰撞氣均為高純氬氣；使

用前應調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求；

f)錐孔電壓、碰撞能量等電壓值應優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度；

g)定性離子對、定量離子對，錐孔電壓及碰撞能量見表2。

表2羥基多環(huán)芳烴特征離子參考質(zhì)譜條件

化合物保留時間（min）離子對錐孔電壓（V）碰撞能量（eV）

143.10>115.13*4830

1-羥基萘7.37

143.10>143.154818

143.10>115.13*2526

2-羥基萘6.20

143.10>143.462514

181.10>152.87*2528

2-羥基芴15.30

181.10>180.292520

181.10>152.93*4018

3-羥基芴14.94

181.10>180.024020

193.10>165.13*2534

1-羥基菲18.76

193.10>193.152542

193.10>165.13*2536

2-羥基菲17.41

193.10>193.212532

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193.10>165.12*2536

3-羥基菲17.71

193.10>192.722536

193.10>165.13*2534

4-羥基菲19.75

193.10>193.152542

217.10>189.09*2538

1-羥基芘22.67

217.10>217.052544

1-羥基萘-D86.91150.07>122.122528

2-羥基萘-D85.84150.07>122.172528

3-羥基芴-D914.49190.16>162.003028

1-羥基菲-D918.26202.16>174.213036

2-羥基菲-D917.02202.16>174.216234

1-羥基芘-D922.32226.16>198.233844

帶*為定量離子

9.1.3標準曲線的制作

將系列標準工作液分別注入超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測得相應的峰面積，以標準工作液的質(zhì)

量濃度為橫坐標，以被測組分的峰面積和內(nèi)標物的峰面積之比為縱坐標，繪制標準曲線。標準溶液的質(zhì)

譜圖參見附錄B。

9.1.4試樣溶液的測定

將試樣待測液注入超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中，以保留時間定性，測得相應的峰面積，根據(jù)標準

曲線得到試樣待測液中羥基多環(huán)芳烴的質(zhì)量濃度。如果試樣待測液中被測物質(zhì)的響應值超出儀器檢測的

線性范圍，可適當稀釋后測定。

9.2空白試驗

除不加試樣外，采用相同的測定步驟進行操作。

10結(jié)果計算和表述

試料中羥基多環(huán)芳烴的含量Xi按式（1）計算。

·························································(1)

?×V

式中：C

X?=??

Xi—試樣中羥基多環(huán)芳烴i的含量，單位為微克每毫升（μg/L）；

Ci—標準工作溶液測得相應被測組分溶液濃度，單位為微克每毫升（μg/L）；

V—試樣溶液定容體積，單位為微升（μL）；

Vi—試樣溶液取樣體積，單位為微升（μL）；

注：計算結(jié)果需扣除空白值。測定結(jié)果用兩次平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

11方法的靈敏度、準確度和精密度

11.1靈敏度

本方法1-羥基萘、2-羥基萘、2-羥基芴、3-羥基芴、1-羥基菲、2-羥基菲、3-羥基菲、4-羥基菲、

1-羥基芘檢出限為0.002μg/L，定量限為0.005μg/L。

11.2準確度

本方法中羥基多環(huán)芳烴在0.1μg/L～10.0μg/L的添加濃度水平時，回收率為60%～120%。

11.3精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。

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附錄A

（資料性）

化合物中英文名稱、化學分子式和CAS號

化合物中英文名稱、化學分子式和CAS號見表A.1。

表A.19種羥基多環(huán)芳烴及內(nèi)標中英文名稱、化學分子式和CAS號

序號名稱英文名稱分子式CAS號

11-羥基萘1-hydroxynaphthaleneC10H8O90-15-3

22-羥基萘2-hydroxynaphthaleneC10H8O135-19-3

32-羥基芴2-hydroxyfluoreneC13H10O2443-58-5

43-羥基芴3-hydroxyfluoreneC13H10O6344-67-8

51-羥基菲1-hydroxyphenanthreneC14H10O2433-56-9

62-羥基菲2-hydroxyphenanthreneC14H10O605-55-0

73-羥基菲3-hydroxyphenanthreneC14H10O605-87-8

84-羥基菲4-hydroxyphenanthreneC14H10O7651-86-7

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