DB52∕T 1501.16-2020 農(nóng)作物抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范 第16部分：白菜抗蕪菁花葉病毒病

農(nóng)作物抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范第16部分：白菜抗蕪菁花葉病毒病I 1 1 1 25抗病性評(píng)價(jià) 3附錄A(資料性附錄)蕪菁花葉病毒病原、癥狀及發(fā)生流行規(guī)律 4附錄B(資料性附錄)蕪菁花葉病毒病原鑒定及保存方法 5附錄C(資料性附錄)白菜蕪菁花葉病毒病抗病性鑒定記載、評(píng)價(jià)表 8《農(nóng)作物抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范》分為17個(gè)部分：——第1部分：水稻抗稻瘟?。弧?部分：水稻抗稻曲?。弧?部分：水稻抗紋枯?。弧?部分：小麥抗條銹病；——第5部分：小麥抗白粉病；——第6部分：小麥抗紋枯病；——第7部分：馬鈴薯抗晚疫病；——第8部分：玉米抗絲黑穗病；——第9部分：玉米抗大斑病；——第10部分：玉米抗小斑病；——第11部分：玉米抗灰斑??；——第12部分：玉米抗南方銹?。弧?3部分：辣椒抗枯萎?。弧?4部分：辣椒抗炭疽?。弧?5部分：白菜抗根腫?。弧?6部分：白菜抗蕪菁花葉病毒??；——第17部分：大豆抗大豆花葉病毒病。本部分為《農(nóng)作物抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范》的第16部分。本部分按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本部分由貴州省植物保護(hù)研究所提出。本部分由貴州省植物保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(GZ/TC16)歸口。本部分起草單位：貴州省植物保護(hù)研究所長(zhǎng)順縣果蔬站榕江縣植保植檢站黔東南州植保植檢站黎平縣植保植檢站。本部分主要起草人：王莉爽、劉茜、范剛強(qiáng)、江滋瓊、李淳、陳小均、劉學(xué)輝、劉榮平、毛世虎。12規(guī)范性引用文件3術(shù)語(yǔ)和定義24鑒定方法4.1接種體的準(zhǔn)備將準(zhǔn)確鑒定的蕪菁花葉病毒(TuMV)儲(chǔ)藏于-80℃冰箱備用(接種體的鑒定及保存方法見(jiàn)附錄B)。4.2材料培養(yǎng)白菜種子直播于營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽直播1～2粒種，育苗土為專用育苗基質(zhì)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20株。人工氣候室溫度設(shè)置為白天25℃,夜間20℃;光照設(shè)置為每天12h。定期澆水和防治蚜蟲(chóng)。4.3.1接種時(shí)期4.3.2接種方法菌過(guò)的研缽中，加入5倍體積的磷酸緩沖液(0.05mol/L,PH=7.2)研磨勻漿，兩層紗布過(guò)濾，立即用回摩擦2～4次，摩擦后用雙蒸水立即沖洗葉面；接種后，黑暗24h再恢復(fù)光照。4.3.3接種后的植株管理4.4.1調(diào)查時(shí)間待鑒定材料長(zhǎng)至6葉期(一般接種后21d~30d)進(jìn)行抗病性調(diào)查。4.4.2調(diào)查和計(jì)算方法共調(diào)查2次，接種后21d調(diào)查1次病毒病發(fā)病情況，28d調(diào)查第2次。用公式1計(jì)算病情指數(shù)，根據(jù)4.4.3病情分級(jí)3病情級(jí)別0植株正常生長(zhǎng)，無(wú)任何癥狀。1接種葉和心葉初現(xiàn)癥狀。3感病葉片數(shù)占全株葉片數(shù)1/3以下。5感病葉片數(shù)占全株葉片數(shù)的1/3~1/2.7感病葉片數(shù)占全株葉片數(shù)1/2以上。9多數(shù)葉片重花葉，皺縮，畸形或有壞死斑，植株嚴(yán)重矮化，甚至死情指數(shù)達(dá)50時(shí)，視為該批次鑒定有效?？共⌒栽u(píng)價(jià)分級(jí)見(jiàn)表2。蕪菁花葉病毒抗病性級(jí)別平均病情指數(shù)(DI)0免疫(I)1抗病(R)35中感(MS)7感病(S)9高感(HS)4A.1病原圖A.1馬鈴薯Y病毒屬病毒粒子圖(756nm×13nm)A.2癥狀化、整株畸形、生育期推遲甚至死亡等(圖A.2)。5a)取1ml裂解液，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中i)加入500μL漂洗液(檢查加入無(wú)水乙醇),12,000rpm離心1min,棄掉廢液；j)重復(fù)步驟9一次；1)取出吸附柱，放入一個(gè)RNasefree離心管中，加50μL~80μLRNasefreewater,室溫總體積6b)70℃孵育5min,立即置于冰上冷卻至少5min(為了使RNA模板充分變性，提高反轉(zhuǎn)錄的效率)。按照如下表格所示的體系向離心管中繼續(xù)加入反應(yīng)所需的其它試劑20μL,輕輕混勻。表B.2cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑體系GoScripTM5×ReactionGoScripTMReverseTranscriptase總體積B.1.3RT-PCR的擴(kuò)增a)TuMV-F:5'-TAAACGGAATGTb)TuMV-R:5'-GTCCTCGGTCGTATGCCTTTCC-3’。表B.3PCR的反應(yīng)體系表B.4PCR的反應(yīng)條件時(shí)間94℃(預(yù)變性)94℃(變性)55℃(退火)72℃(延伸)72℃(徹底延伸)7B.1.4.1統(tǒng)計(jì)好需檢測(cè)樣品的個(gè)數(shù)，選擇合適的梳子和板子。B.1.4.2準(zhǔn)備1個(gè)量程為250mL的三角瓶，稱取0.25g瓊脂糖(Agarose)至三角瓶，再向三角瓶中加B.1.4.3混勻后將三角瓶置于微波爐中高火加熱，等瓶?jī)?nèi)固體完全熔解后，再放置桌面冷卻。B.1.4.4將三角瓶?jī)?nèi)的液體全部倒入已插好B.1.4.5等30min后瓊脂糖將會(huì)完全冷卻并凝固，再小心拔B.1.4.6清洗干凈核酸電泳槽之后，往電泳槽內(nèi)倒入適量的1×TAE電泳緩沖液，當(dāng)B.1.4.9利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照記錄。B.2病原物鑒定及保存種緩沖液，摩擦接種到枯斑三生煙(或心葉煙),7d~10d待煙葉上長(zhǎng)出枯斑，挑取單個(gè)枯斑再次接種到煙葉，重復(fù)2次。純化后TuMV接種到易感病白菜活體保存或?qū)⒓兓笫忀蓟ㄈ~病毒的樣品儲(chǔ)藏于-80℃冰箱備用。將純化的TuMV毒源接種到感病品種的白菜(如和美五號(hào)，經(jīng)室內(nèi)和田間鑒定為感病),顯癥后用8播種(移栽)日期：鑒定地點(diǎn)：經(jīng)緯度：海