2025屆高考生物二輪復(fù)習(xí)講義微專題+++++基因工程

基因工程知識構(gòu)建1．限制酶的選擇技巧(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點選擇限制酶①應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇限制酶SmaⅠ。②為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也能被切出相同的黏性末端，如圖乙)。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點選擇限制酶(如圖)(3)根據(jù)Ti質(zhì)粒的T－DNA片段選擇限制酶。圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取(假設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)。2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程(如圖)3．Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)(1)Cre重組酶：由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼，具有限制酶特性，能夠特異性識別LoxP位點。能介導(dǎo)兩個LoxP位點之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。(2)LoxP序列：來源于P1噬菌體，包括兩個13bp的反向重復(fù)序列和一個8bp的間隔區(qū)域，反向重復(fù)序列是Cre重組酶的特異識別位點，而間隔區(qū)域決定了LoxP位點的方向。(3)①同向LoxP：如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列，僅保留一個LoxP。②反向LoxP：如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個LoxP位點間的序列倒位。4．CRISPR/Cas9基因編輯CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌體內(nèi)的用來對抗侵略細(xì)菌的外源DNA或噬菌體的基因編輯系統(tǒng)。CRISPR是成簇的、規(guī)律間隔的、短回文重復(fù)DNA序列。Cas9蛋白是一種RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切核酸酶，當(dāng)細(xì)菌受到噬菌體的侵染時，噬菌體的某段DNA序列被Cas9內(nèi)切酶剪切后整合到CRISPR的間隔序列區(qū)域，當(dāng)相同種類的噬菌體再次侵染細(xì)菌時，轉(zhuǎn)錄的crRNA可以引導(dǎo)Cas9蛋白找到并切斷噬菌體(形成平末端)釋放到細(xì)菌體內(nèi)的DNA，從而阻止噬菌體在細(xì)菌體內(nèi)繁殖。其作用機(jī)制大體可以分為三個步驟：(1)內(nèi)切酶(Cas9酶)切割噬菌體獲取新的間隔序列；(2)將其引入原間隔序列并轉(zhuǎn)錄出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成復(fù)合物精準(zhǔn)切割與新間隔序列相同的基因。具體過程如圖所示。5．In－Fusion技術(shù)In－Fusion技術(shù)即無縫克隆和組裝技術(shù)，是一種新型的、快速、簡潔的克隆方法，可以在質(zhì)粒的任何位點進(jìn)行一個或多個目標(biāo)DNA片段的插入。具體原理：在載體末端和目的基因兩端應(yīng)具有15～25個同源堿基，而目的基因兩端的同源序列往往是通過引物設(shè)計實現(xiàn)的，In－Fusion酶能夠識別具有相同末端序列的線性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA連接酶再將兩條DNA單鏈黏合起來。(1)質(zhì)粒構(gòu)建過程：①采用酶切或者PCR擴(kuò)增方法將載體線性化；②使用設(shè)計好的引物進(jìn)行目的DNA片段的PCR擴(kuò)增；③反應(yīng)體系內(nèi)形成重組質(zhì)粒。(2)與傳統(tǒng)酶切、酶連相比的優(yōu)勢：①位點選擇靈活，在載體任意位置進(jìn)行基因克??；②快速簡便；③克隆效率高，陽性克隆高達(dá)90%以上；④可同時克隆兩個或多個DNA片段。

真題演練1．(2024·全國甲，38節(jié)選)質(zhì)粒載體上有限制酶a、b、c的酶切位點，限制酶的切割位點如圖所示。構(gòu)建重組質(zhì)粒時，與用酶a單酶切相比，用酶a和酶b雙酶切的優(yōu)點體現(xiàn)在____________________________________________________________________________________________________________________________________(答出兩點即可)；使用酶c單酶切構(gòu)建重組質(zhì)粒時宜選用的連接酶是________。2．(2023·全國乙，38節(jié)選)GFP是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以GFP基因為材料，利用基因工程技術(shù)獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白?？蒲腥藛T從構(gòu)建的GFP突變基因文庫中提取目的基因(均為突變基因)構(gòu)建表達(dá)載體，其模式圖如圖所示(箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄方向)。圖中①為________；②為________，其作用是________________________________________________________________________________________________________________________________________________；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標(biāo)記基因，其作用是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。3．(2022·福建，13節(jié)選)載體和CD14片段的酶切位點及相應(yīng)的酶切抗性基因序列如圖所示。用XhoⅠ和SalⅠ分別酶切CD14和圖中載體連接，CD14接入載體時會形成正向連接和反向連接的兩種重組DNA?？蛇M(jìn)一步用這兩種限制酶對CD14的連接方向進(jìn)行鑒定，理由是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。4．(2024·新課標(biāo)，35節(jié)選)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細(xì)菌(B1)的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如圖所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列問題：(1)限制酶切割的化學(xué)鍵是__________。為保證N基因能在菌株B2中表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點之間，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細(xì)菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對可以形成的堿基對有G－C和________________________________________________________________________。5．(2024·湖南，21節(jié)選)百合具有觀賞、食用和藥用等多種價值，科研人員對其進(jìn)行了多種育種技術(shù)研究。研究人員從野生百合中獲得一個抵抗尖孢鐮刀菌侵染的基因L，該基因及其上游的啟動子pL和下游的終止子結(jié)構(gòu)如圖a。圖b是一種Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中基因gus編碼GUS酶，GUS酶活性可反映啟動子活性。(1)研究病原微生物對L的啟動子pL活性的影響。從圖a所示結(jié)構(gòu)中獲取pL，首先選用________酶切，將其與相同限制酶酶切的Ti質(zhì)粒連接，再導(dǎo)入煙草。隨機(jī)選取3組轉(zhuǎn)基因成功的煙草(P1、P2和P3)進(jìn)行病原微生物脅迫，結(jié)果如圖c。由此可知：三種病原微生物都能誘導(dǎo)pL的活性增強(qiáng)，其中______________的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。(2)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)栽培種百合B中也有L，但其上游的啟動子與野生百合不同，且抗病性弱。若要提高該百合中L的表達(dá)量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種，簡要寫出實驗思路：________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。6．(2023·海南，20節(jié)選)我國開發(fā)了一種新型基因遞送系統(tǒng)(切—浸—生芽，簡稱CDB法)。圖1與圖2分別是利用常規(guī)轉(zhuǎn)化法和CDB法在某植物中遞送基因的示意圖。則：(1)圖1與圖2中，農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時，可將外源基因遞送到植物細(xì)胞中的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)已知某酶(PDS)缺失會導(dǎo)致植株白化。某團(tuán)隊構(gòu)建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體(含有綠色熒光蛋白標(biāo)記基因)，利用圖2中的CDB法將該重組載體導(dǎo)入植株B，長出毛狀根，成功獲得轉(zhuǎn)化植株B。據(jù)此分析，從毛狀根中獲得陽性毛狀根段的方法是________________________，圖2中，鑒定導(dǎo)入幼苗中的基因編輯載體是否成功發(fā)揮作用的方法是________________________________________________________________________，依據(jù)是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。

模擬練1．研究人員將靛藍(lán)色素酶基因(IDG)與啟動子PTL12(棉纖維細(xì)胞特異啟動子)相連以構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖，KpnⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ代表不同限制酶，圖中質(zhì)粒上酶的位置為其對應(yīng)的酶切位點)，并最終培育出能在棉纖維細(xì)胞中表達(dá)靛藍(lán)色素酶的彩色棉新品種。本研究中將IDG與啟動子PTL12結(jié)合的主要目的是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。過程①②都使用KpnⅠ切割質(zhì)粒，目的是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。2．(2024·天津?qū)幒訁^(qū)高三一模)藍(lán)細(xì)菌中的ictB蛋白能高效轉(zhuǎn)運(yùn)和濃縮CO2，從而提高細(xì)胞光合速率。我國科學(xué)家構(gòu)建了葉片特異性啟動子Cab(葉綠體捕光色素蛋白Cab基因啟動子)驅(qū)動的藍(lán)細(xì)菌ictB基因表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)ictB基因水稻，大大提高了水稻的產(chǎn)量。在ictB基因表達(dá)載體的構(gòu)建中，含Cab啟動子和ictB基因的重組DNA分子和Ti質(zhì)粒的酶切位點如圖1所示。請回答下列問題：(1)為使重組DNA分子能定向插入T－DNA中，可用PCR的方法在重組DNA分子兩端添加限制酶識別序列，據(jù)圖可知，M端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是________，N端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是________。添加了限制酶識別序列的重組DNA分子與Ti質(zhì)粒的重組過程共需要______種酶。(2)將農(nóng)桿菌液浸泡過的水稻愈傷組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入____________進(jìn)行篩選，最終獲得多個水稻株系a1、a2、a3、a4。對a1～a4四個水稻株系的ictB蛋白表達(dá)量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2，其中a4株系ictB蛋白表達(dá)量較低的原因可能是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。檢測應(yīng)選用的植物器官是______，原因是____________________________________________________________________________________________________________________________。3．隨著土壤鹽漬化(主要是Na＋引起)不斷加劇，提高耐鹽性已成為研究和改良作物的重要方向。從高鹽環(huán)境中吸收K＋可維持細(xì)胞內(nèi)K＋/Na＋穩(wěn)態(tài)，從而提高植物的耐鹽性。H是細(xì)胞膜上的一種K＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，B蛋白可以增強(qiáng)H的功能。為探究作用機(jī)理，研究人員構(gòu)建了兩個分別含有CFP－B和YFP－H融合基因的表達(dá)載體。CFP和YFP分別是青色熒光蛋白基因和黃色熒光蛋白基因。為了獲得含CFP－B的表達(dá)載體，選擇了已經(jīng)包含CFP的載體p1300－CFP。相關(guān)信息如圖所示。請回答下列問題：(1)為將B基因連入CFP基因，需使用兩端帶有酶切位點序列的引物擴(kuò)增B基因，優(yōu)先選擇的酶切位點是________________，理由是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)據(jù)此，研究人員使用的兩條引物序列分別為5′－XXXXXXNNATGGCCGGC－3′和5′－YYYYYYCTACTCAGA－3′。X和Y分別代表(1)選擇的酶切位點，N代表任意堿基的核苷酸。第一條引物中NN的作用是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。第二條引物與圖中B基因末端序列不相同的原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。用同樣的方法獲得了含YFP－H融合基因的表達(dá)載體。4．通過體內(nèi)同源重組可以進(jìn)行靶向基因敲除，原理如圖1所示。同源重組技術(shù)結(jié)合tetr－sacB雙重選擇系統(tǒng)可對基因進(jìn)行敲除與回補(bǔ)，研究基因的功能。圖2是科研人員利用該方法對大腸桿菌LacZ基因進(jìn)行敲除與回補(bǔ)的相關(guān)過程，其中tetr是四環(huán)素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表達(dá)產(chǎn)物能將無色化合物X－gal水解成藍(lán)色化合物?；卮鹣铝袉栴}：限制酶EcoRⅠBamHⅠHindⅢXmaⅠ識別序列和切割位點↓5′—GAATTC—3′↓5′—GGATCC—3′↓5′—AAGCTT—3′↓5′—CCCGGG—3′(1)據(jù)圖1分析，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，體內(nèi)同源重組具有的特點是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)圖2過程①中，設(shè)計兩種引物時需在引物5′端分別添加________、________限制酶的識別序列；過程⑤中，設(shè)計兩種引物時需在引物5′端分別添加________基因兩端的同源序列。(3)圖2過程⑦中，在含有____________的培養(yǎng)基中出現(xiàn)了白色菌落，即為篩選出的敲除LacZ基因菌株。過程⑧通過同源重組技術(shù)結(jié)合tetr－sacB雙重選擇系統(tǒng)可對LacZ基因進(jìn)行回補(bǔ)，篩選LacZ基因回補(bǔ)菌株時應(yīng)在培養(yǎng)基中添加____________。5．PMP22基因在人基因組中有多個拷貝，表達(dá)產(chǎn)生的PMP22蛋白在人髓鞘細(xì)胞中不可或缺，但PMP22蛋白過量可引發(fā)腓骨肌萎縮癥(CMT1A)，科研人員希望利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)治療CMT1A。回答下列問題：(1)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)原理如圖1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA雙鏈，造成DNA損傷，一次切割過程中會產(chǎn)生______個游離的磷酸基團(tuán)。機(jī)體修復(fù)DNA損傷時，可能會改變堿基序列。圖中g(shù)RNA的作用是___________________________________。(2)科研人員本來的基因編輯方案是將gRNA結(jié)合位點設(shè)計在PMP22基因內(nèi)部，后改為如圖2所示的方案，該方案比起原方案的優(yōu)點是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)科研人員希望在人髓鞘細(xì)胞中表達(dá)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，構(gòu)建的基因表達(dá)載體如圖3所示。①在對gRNA對應(yīng)的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，需要在上游和下游引物的5′端分別添加堿基序列________________和________________，保證DNA片段定向插入。②基因表達(dá)載體上，除了圖示序列和標(biāo)記基因外，還需要的序列是________。6．(2024·青島高三二模)某種雄性不育水稻是由野生型水稻的核基因M突變?yōu)閙所致，科研團(tuán)隊構(gòu)建轉(zhuǎn)基因智能不育系的思路是將育性恢復(fù)基因OsNP1(在原始生殖細(xì)胞中表達(dá))、花粉失活基因ZM－AA(在花粉中表達(dá))兩個基因一起構(gòu)建重組Ti質(zhì)粒。然后通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胗鷤M織細(xì)胞，從轉(zhuǎn)基因后代中篩選m位點是純合但兩個轉(zhuǎn)基因位點是雜合的可育植株。(1)圖1為已導(dǎo)入ZM－AA基因的重組Ti質(zhì)粒，圖2為OsNP1基因和相應(yīng)的酶切位點，其中A鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈。為使OsNP1基因與圖1中Ti質(zhì)粒正確連接來構(gòu)建基因表達(dá)載體，應(yīng)選擇的酶有______________________________；采用PCR技術(shù)擴(kuò)增圖2中的OsNP1基因時，會出現(xiàn)長、中、短三種長度的單鏈，一個OsNP1基因在第n次循環(huán)中新合成的短鏈數(shù)為________。(2)重組Ti質(zhì)粒中的新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的具體作用分別是________________________________________________________________________________________________________________________________________________、________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)若使兩個基因分別在不同的細(xì)胞中表達(dá)，需將兩個基因分別與______________________________________________________________________________________________________________________________________________重組在一起。

答案精析真題演練1．避免目的基因和質(zhì)粒的反向連接、防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化T4DNA連接酶2．終止子啟動子RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來3．正向連接的重組DNA有這兩種酶切位點(限制酶的識別序列)；而反向連接的重組DNA會形成新的序列，沒有這兩種酶的酶切位點(沒有限制酶的識別序列)4．(1)磷酸二酯鍵不破壞N基因，使M1與M2之間有啟動子、N基因、終止子，能保證N基因正常表達(dá)(2)C－G、A－T、U－A5．(1)HindⅢ、BamHⅠ交鏈格孢(2)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將百合B中基因L的啟動子替換為野生百合中基因L的啟動子pL解析(1)根據(jù)目的片段以及質(zhì)粒上限制酶的識別位點，若要獲得啟動子pL并連接到質(zhì)粒上，可選用限制酶HindⅢ、BamHⅠ進(jìn)行酶切，以替換Ti質(zhì)粒中的啟動子，從而達(dá)到根據(jù)GUS酶活性反映啟動子活性的目的。根據(jù)圖c的結(jié)果可知，交鏈格孢處理的每一組轉(zhuǎn)基因煙草中的GUS酶活性都最高，可確定其誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。(2)欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種，可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將百合B中基因L的啟動子替換為野生百合中基因L的啟動子pL。6．(1)農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒中的T－DNA能將外源基因遞送到植物細(xì)胞中，并與植物細(xì)胞的染色體DNA整合到一起(2)熒光檢測選擇帶有綠色熒光標(biāo)記的毛狀根觀察幼苗是否表現(xiàn)出白化特征PDS缺失會導(dǎo)致植株白化，白化苗的出現(xiàn)意味著通過基因編輯技術(shù)成功實現(xiàn)PDS基因的敲除模擬預(yù)測1．PTL12是棉纖維細(xì)胞特異啟動子，將IDG與特異啟動子PTL12結(jié)合可以使IDG基因在棉纖維細(xì)胞中特異表達(dá)形成相同的黏性末端，使PTL12片段能與IDG按設(shè)計方向正確連接，保證IDG的正確表達(dá)2．(1)BglⅠEcoRⅤ4(2)潮霉素a4水稻株系中沒有導(dǎo)入目的基因或目的基因未表達(dá)葉片Cab啟動子是葉片特異性啟動子，它使ictB基因只能選擇性地在葉片中表達(dá)解析(1)據(jù)圖1可知，重組DNA分子中有BamHⅠ的酶切位點，故不能選擇BamHⅠ，又因為Sau3AⅠ也可識別BamHⅠ的酶切位點，故也不能選擇Sau3AⅠ，又由于SpeⅠ能切割Cab啟動子，也不能選擇，故只能選擇BglⅠ和EcoRⅤ，再根據(jù)啟動子的方向可知，M端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是BglⅠ，N端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是EcoRⅤ；添加了限制酶識別序列的重組DNA分子與Ti質(zhì)粒的重組過程共需要4種酶，分別是BglⅠ、EcoRⅤ、DNA連接酶和