2025屆高考生物二輪專題復習與測試板塊六生物技術與工程命題最前沿十三PCR與電泳的原理及應用課件

[命題最前沿十三]

PCR與電泳的原理及應用1．PCR(1)PCR考點總結精華——應對高考至少應該掌握的知識點①PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫，原理是DNA半保留復制。所需條件包括模板、原料(4種脫氧核苷酸)、引物(2種)和耐高溫的DNA聚合酶。其實質是在體外對目的基因進行大量復制。②用PCR儀控制溫度：加熱變性破壞氫鍵(超過90℃)→復性(50℃左右)→延伸(72℃左右)，需在耐高溫的DNA聚合酶(不需要解旋酶、限制酶、DNA連接酶)的作用下進行。三步反應完成后，兩引物間固定長度的DNA序列在PCR擴增3次后首先出現(xiàn)，隨著重復次數(shù)的增多，DNA分子數(shù)目就以2n的形式增加。③利用PCR擴增目的基因(如干擾素基因)時，設計引物序列的主要依據(jù)是有一段已知目的基因(干擾素基因)的核苷酸序列。所以引物是一小段單鏈DNA。復制方向是沿子鏈5′→3′，當擴增4次，共產(chǎn)生16個DNA時，消耗30個引物。(2)PCR中“引物”歸類分析①引物的作用：TaqDNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈。當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，TaqDNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈。不同引物可結合不同的目的基因并進行擴增。②設計引物應遵循的主要原則a．引物長度應大于16個核苷酸，可防止隨機結合。b．引物與靶序列間的Tm(指當50%的引物和靶序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度)不應過低。c．引物不應有發(fā)夾結構，即不能有4bp以上的回文序列。d．2個引物間不應有4bp以上的互補序列或同源序列。e．引物中堿基的分布應盡可能均勻，G＋C含量接近50%。③引物的處理由于引物延伸從3′端開始，3′端不能進行任何修飾，引物5′端對擴增特異性影響不大，因此，可給予修飾而不影響擴增特異性。引物5′端修飾包括加酶切位點、標記生物素、熒光等。為了使經(jīng)PCR擴增的目的基因能與載體正常結合，需要在2種引物的5′端添加不同的限制酶的識別序列。其目的是保證目的基因定向插入載體并避免目的基因自身環(huán)化。(3)PCR循環(huán)時與引物相關的計算PCR經(jīng)過n次循環(huán)產(chǎn)生的DNA數(shù)為2n，一共有2n＋1條鏈，其中有2條鏈是DNA母鏈，不含引物，其他的每1條鏈均含1個引物，并且2種引物的數(shù)量相等，故PCR過程經(jīng)過n次循環(huán)，需要的引物總個數(shù)是2n＋1－2，需要某一種引物的總個數(shù)是(2n＋1－2)×(1/2)＝2n－1。一個DNA由1條母鏈和第1種引物延伸的子鏈組成，另一個DNA由另1條母鏈和第2種引物延伸的子鏈組成，其他的DNA均由2種引物延伸的2條子鏈組成。2．電泳的原理及應用DNA電泳是基因工程中最基本的技術。近年來基于DNA電泳圖譜分析與比較，結合高中所學的基因診斷、DNA指紋技術以及基因克隆等相關內(nèi)容的遺傳學試題較為常見。以遺傳學基本知識為背景，以DNA電泳圖譜為情境，強調(diào)情境與立意相結合，體現(xiàn)高考能力考核目標和要求，很好地考查學生的獲取與處理表達信息能力和應用分析能力。(1)DNA電泳原理DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子大小和構象等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。(2)蛋白質電泳原理蛋白質電泳常用方法是SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結構的凝膠。蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。(3)電泳的應用電泳技術已廣泛用于核酸等成分的分離和鑒定。核酸的電泳條帶只表示它們的種類，不表示數(shù)量，不同條帶代表分子量不同的片段。1．某二倍體動物種群有100個個體，其常染色體上某基因有A1、A2、A3三個等位基因。對這些個體的基因A1、A2、A3進行PCR擴增，凝膠電泳及統(tǒng)計結果如圖所示。該種群中A3的基因頻率是(

)A．52%

B.27%C.26%

D.2%√解析：分析題圖可知，該動物種群個體數(shù)為100個，其中有2個個體的基因型為A3A3，15個個體的基因型為A1A3，35個個體的基因型為A2A3，則A3的基因頻率＝(2×2＋15＋35)÷(100×2)×100%＝27%，B符合題意。2．亞洲棉的突變型光籽和野生型毛籽是一對相對性狀，研究發(fā)現(xiàn)，亞洲棉某突變體的光籽表型與8號染色體的～880kb至～903kb區(qū)間相關，研究人員根據(jù)野生型毛籽棉的該區(qū)間設計連續(xù)的重疊引物進行PCR，產(chǎn)物擴增結果如下圖所示，下列說法錯誤的是(

)A．應提取該突變體和野生型亞洲棉的全部染色體DNA進行PCRB．上圖中PCR產(chǎn)物的鑒定是通過瓊脂糖凝膠電泳來進行的C．據(jù)圖分析可知，分子量較大的擴增產(chǎn)物與點樣處的距離較小D．該突變體出現(xiàn)的根本原因是第6對引物對應區(qū)間發(fā)生了基因突變√3．某研究小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3—GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產(chǎn)物電泳結果如圖乙所示。下列敘述正確的是(

)A．Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因表達B．翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3—GFP基因純合子D．若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子√解析：由圖甲可知，Gata3基因與GFP基因共用一個啟動子，且由題干可知兩基因能正常表達出相關蛋白質，A錯誤；由于啟動子在左側，基因在右側，轉錄基因時，先轉錄Gata3基因，再轉錄GFP基因，由于翻譯的方向是沿mRNA的5′→3′，因此翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；由圖乙可知，大片段包含GFP基因編碼區(qū)片段，小片段不包含GFP基因編碼區(qū)片段，則2號小鼠是Gata3—GFP基因純合子，4號小鼠是野生型，C錯誤；若用引物1和引物3進行PCR，雜合子和Gata3—GFP基因純合子均能擴出條帶，僅有Gata3基因時無法擴出條帶，不利于區(qū)分雜合子和純合子，D錯誤。4．構筑病毒防線需要兩種措施：一種是病毒檢測，以阻斷傳播途徑；另一種是疫苗研制，以增強人體免疫力。常采用RT-PCR技術(逆轉錄熒光PCR技術)檢測多種病毒感染。該技術的原理是在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針，當DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處時會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)記錄到熒光信號，即每個熒光探針被水解就有一個熒光信號生成并被準確記錄(如下圖)?；卮鹣铝袉栴}：(1)PCR反應體系中需要添加模板、原料、酶、引物等，其中引物的作用是使TaqDNA聚合酶能夠從引物的________端開始連接脫氧核苷酸。從理論上推測，PCR擴增1個目的基因至第六輪循環(huán)結束，共記錄到________個熒光信號，第六輪循環(huán)將消耗________個引物1。(2)根據(jù)某病毒核酸序列設計的引物1為GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT，______(填“能”或“不能”)依據(jù)此序列設計出引物2的序列。如果待測樣本中沒有檢測到熒光信號，初步推測樣本中________(填“含有”或“不含有”)相應病毒。3′6332不能不含有5．苯丙酮尿癥是由PKU基因突變引起的，基因定點整合可以將正常PKU基因定點整合到PKU基因突變的小鼠胚胎干細胞的染色體DNA上，替換突變基因，用于研究該病的治療?；蚨c整合的過程是從染色體DNA的突變PKU基因兩側各選擇一段DNA序列HB1和HB2，根據(jù)其堿基序列分別合成HB1和HB2，再將兩者分別與基因K1、K2連接，中間插入正常PKU基因和標記基因neor，構建出如圖所示的重組載體。重組載體和染色體DNA中的HB1和HB2序列發(fā)生交換，導致兩者之間區(qū)域發(fā)生互換(如下圖)。回答下列問題：(1)構建重組載體時，需采用PCR對PKU基因進行擴增，擴增時，需要先加熱超過90℃使DNA解聚為單鏈，后冷卻至50℃左右的目的是_____________________________。使引物結合到互補的DNA鏈上(2)重組載體中的HB1和HB2之間除了插入正常的PKU基因和neor基因以外，還必須含有_________________。neor基因的作用是_______________________________________________。啟動子、終止子鑒定與篩選含有正常PKU基因的胚胎干細胞(3)用圖中重組載體轉化時，會出現(xiàn)一些PKU基因錯誤整合的胚胎干細胞。錯誤整合時，載體的兩個K基因中至少會有一個與neor基因一起整合到染色體DNA上，已知含有neor基因的細胞具有G418的抗性。K1、K2的產(chǎn)物都能把DHPG轉化成有毒物質而使細胞死亡。根據(jù)上述信息，設計簡要的實驗方案從轉化的胚胎干細胞中篩選出正確整合的胚胎干細胞。_______________________________________________。在含G418和DHPG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)轉化的胚胎干細胞，能夠存活的即為正確整合的胚胎干細胞6．定點誘變技術是近年來生物工程研究中發(fā)展迅速的一個領域。通過定點誘變可以在體外改造目的DNA分子，進而研究基因的表達以及蛋白質的結構與功能之間的關系。經(jīng)典的大引物PCR定點誘變技術成為基于PCR的定點誘變技術中應用最普遍的方法，操作過程如圖甲。研究者欲改造某基因并將其導入大腸桿菌的質粒中保存，該質粒含有氨芐青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位點，結構如圖乙?；卮鹣铝袉栴}：(1)利用大引物PCR進行定點誘變需要進行兩輪PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要________個循環(huán)才能獲得相應的大引物模板。在PCR2中，要獲得帶有誘變點的改良基因，引物應選用大引物兩條鏈中的________(填“①”或“②”)。(2)為實現(xiàn)質粒和改良基因的高效連接，選用限制酶Xma

Ⅰ而不選用限制酶Sma

Ⅰ的原因是__________________________________________________________________________________。為將改良基因構建在質粒上，還需要_____________________等酶。2②Sma

Ⅰ的酶切末端為平末端，無法與改良基因上的黏性末端