3-2-基因工程的基本操作程序3-課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修

3.2基因工程的基本操作程序1.基因工程的基本操作程序2.基因工程每一步涉及的技術(shù)和方法目的基因的篩選和獲取-前提利用PCR獲取和擴(kuò)增化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體-核心目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞-關(guān)鍵花粉管通道法(植物)、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法(微生物);目的基因的檢測與鑒定-保證分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強(qiáng)度等。4.目的基因的檢測與鑒定1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性？證據(jù)是什么？

科研人員對長江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉進(jìn)行了監(jiān)測，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護(hù)所，靶標(biāo)害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。2.科研工作者在沒有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個殺蟲基因、構(gòu)建組織特異性表達(dá)的啟動子、提高殺蟲基因的表達(dá)量等。（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護(hù)所、與其他作物（非抗品種）輪作或套種等。（3）國家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實施分區(qū)種植管理、加強(qiáng)抗性監(jiān)測、進(jìn)行嚴(yán)格的安全生評價等。1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細(xì)胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。（

）（2）構(gòu)建含有afp基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶（

）（3）只要檢測出番茄細(xì)胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功（

）2.利用PCR既可以快速擴(kuò)增特定基因，也可以檢測基因的表達(dá)。下列有關(guān)PCR的敘述錯誤的是（

）

A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶

B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶

C.復(fù)性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補配對原則

D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸√××D1.研究人員在研究轉(zhuǎn)基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩(wěn)定性時，發(fā)現(xiàn)44株轉(zhuǎn)基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德爾遺傳規(guī)律，在它們的自交后代中出現(xiàn)了較多的沒有卡那霉素抗性的植株。請查找相關(guān)資料，嘗試對這個問題作出解釋。

外源基因插入基因組中可能為單位點插入，或者同一染色體多位點插入，或者不同染色體多位點插入。大多數(shù)情況下，插入的位點難以做到定點插入；插入的拷貝數(shù)也是隨機(jī)的。因此，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳是很復(fù)雜的。例如，科研人員在對轉(zhuǎn)GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的煙草進(jìn)行基因表達(dá)分析時，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株的染色體DNA中整合了多個拷貝的基因，從而導(dǎo)致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩(wěn)定性。2.八氫番茄紅素合酶（其基因用psy表示）和胡蘿卜素脫飽和酶（其基因用crtⅠ表示）參與β-胡蘿卜素的合成。pmi為磷酸甘露醇異構(gòu)酶基因，它編碼的蛋白質(zhì)可使細(xì)胞在特殊培養(yǎng)基上生長?？茖W(xué)家將psy和crtⅠ基因轉(zhuǎn)入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡蘿卜素，由此生產(chǎn)出的大米稱為“黃金大米”。請根據(jù)以上信息回答下列問題。（1）科學(xué)家在培育“黃金大米”時，將ctrⅠ和psy基因?qū)牒琾mi基因的質(zhì)粒中，構(gòu)建了質(zhì)粒pSYN12424。該項研究的目的基因是______________________，標(biāo)記基因是__________，質(zhì)粒pSYN12424的作用是________________________________。ctrⅠ基因和psy基因pmi基因?qū)⒛康幕蛩腿胨炯?xì)胞（2）在構(gòu)建質(zhì)粒載體時，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的識別序列？為什么？不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識別序列，限制酶可能將它切斷。(3)請查找相關(guān)資料，了解科學(xué)家為什么要培育“黃金大米”以及當(dāng)前關(guān)于“是否要推廣'黃金大米’”的各種爭論。你還可以提出自己的看法，并與同學(xué)交流討論。

維生素A在人體內(nèi)具有非常重要的生理功能，對視力、骨骼生長、免疫功能等都有調(diào)節(jié)作用。但是，人體不能合成維生素A，需要從食物中攝取。維生素A缺乏癥是南亞地區(qū)常見的由營養(yǎng)不良導(dǎo)致的疾病，該地區(qū)的居民一般以秈稻作為主食。β-胡蘿ト素是維生素A的前體，在人體內(nèi)它可以轉(zhuǎn)化為維生素A。因此，科學(xué)家將兩個參與β-胡蘿ト素合成的酶的基因轉(zhuǎn)入了秈稻中，使其胚乳中富含β-胡蘿ト素，期望讓人們通過日常食用主食就能補充足夠量的維生素A，從而降低維生素A缺乏癥的患病率。關(guān)于“是否要推廣'黃金大米'”的爭論主要圍繞其安全性、有效性等方面展開。1．下列有關(guān)基因工程技術(shù)的正確敘述是（）A．重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制酶、連接酶和載體B．所有的限制酶都只能識別同一種特定的核苷酸序列C．選用細(xì)菌作為重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞是因為細(xì)菌繁殖快D．只要目的基因進(jìn)入了受體細(xì)胞就能成功實現(xiàn)表達(dá)C

2.科學(xué)家運用基因工程技術(shù)將人胰島素基因與大腸桿菌的質(zhì)粒DNA分子重組，并且在大腸桿菌體內(nèi)獲得成功表達(dá)。胰島素基因與大腸桿菌質(zhì)粒DNA結(jié)合的位置，它們彼此能結(jié)合的依據(jù)是（）A．基因自由組合定律B．半保留復(fù)制原則C．基因分離定律 D．堿基互補配對原則D

5.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.DNA體外擴(kuò)增的原理：PCR利用DNA熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。2.DNA片段電泳鑒定的原理：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。如何對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定嗎？瓊脂糖凝膠電泳（1）儀器（2）用具PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭、電泳裝置（包括電泳儀電泳槽等）4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、DNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等3.材料用具5.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3.材料用具5.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL總體積50μL注：模板DNA的用量為1gp～1μg4.方法步驟5.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定

用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。1.PCR加樣：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min2.離心：5.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定4.方法步驟3.擴(kuò)增：將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。4.配制瓊脂糖溶液：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。

將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。

凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。5.制備凝膠：5.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定4.方法步驟將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。5.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定4.方法步驟

將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。6.電泳加樣：7.電泳、觀察：

接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。注意事項1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時，一定要戴好一次性手套。5.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。例1：用PC