第七章 高效液相色譜分析課件

7第七章高效液相色譜分析學(xué)習(xí)目標(biāo)1、掌握HPLC的分離原理、高效液相色譜分析的樣品處理方法、分離方式的選擇和定量分析方法及HPLC實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2、了解高效液相色譜儀的構(gòu)造、儀器各部分的功用及儀器的維護(hù)和保養(yǎng)，熟悉其工作過(guò)程及常用固定相及流動(dòng)相的特性及選用原則。高效液相色譜分析法7第七章高效液相色譜分析一、液相色譜分離原理

特指一種用液體為流動(dòng)相的色譜分離分析方法。液體待檢測(cè)物被注入色譜柱，通過(guò)流動(dòng)相推動(dòng)，在固定相中移動(dòng)，由于被測(cè)物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)以不同的順序離開色譜柱，通過(guò)檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào)，最后通過(guò)分析比對(duì)這些信號(hào)來(lái)判斷待側(cè)物所含有的物質(zhì)。第一節(jié)高效液相色譜分離的原理1、液相色譜分析法7第七章高效液相色譜分析2、液相色譜法分類1）液-液分配色譜法（LLC）2）液-固吸附色譜法（LSC）3）離子交換色譜法（IC）4）空間排阻（凝膠）色譜法7第七章高效液相色譜分析1）液-液分配色譜法（LLC）分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異實(shí)現(xiàn)分離。固定相：載體+固定液（物理或機(jī)械涂漬法）。缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實(shí)用。

極性固定液→NLLC，非極性固定液→RLLC正相色譜——固定液極性>流動(dòng)相極性（NLLC），極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱，適于分離極性組分。反相色譜——固定液極性<流動(dòng)相極性（RLLC），極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱，適于分離非極性組分。7第七章高效液相色譜分析2）液-固吸附色譜法（LSC）流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑。分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異實(shí)現(xiàn)分離。3）離子交換色譜法（IC）分離機(jī)制：離子交換樹脂上可交換的離子基團(tuán)與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)其對(duì)離子交換樹脂上的固定離子基團(tuán)親和力的不同而將溶質(zhì)分子分離。離子對(duì)試劑：烷基磺酸鈉→分析堿；四丁基季胺鹽→分析酸4）空間排阻（凝膠）色譜法以凝膠為固定相的色譜法。分離機(jī)制：溶質(zhì)自身體積大小不同，透過(guò)凝膠的速率不等。7第七章高效液相色譜分析

高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別，它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)器和高效微粒固定相，適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物。

高效液相色譜也叫高壓液相色譜（highpressureliquidchromatography）、高速液相色譜（highspeedliquidchromatography）、高分離度液相色譜（highresolutionliquidchromatography）等。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。二、高效液相色譜分析法的特點(diǎn)7第七章高效液相色譜分析1、高效液相色譜的特點(diǎn)高壓——壓力可達(dá)150～300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。高速——流速為0.1～10.0mL/min。高效——塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。

7第七章高效液相色譜分析2、HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)速度快——通常分析一個(gè)樣品在15～30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高——可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。

靈敏度高——紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。色譜柱可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。7第七章高效液相色譜分析三、HPLC的實(shí)際應(yīng)用未知物質(zhì)的鑒定與確認(rèn)多成分的同時(shí)定量混合物的精制和分離測(cè)定物理化學(xué)常數(shù)HPLC應(yīng)用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個(gè)領(lǐng)域。7第七章高效液相色譜分析第二節(jié)高效液相色譜儀的基本構(gòu)造7第七章高效液相色譜分析高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

高效液相色譜系統(tǒng)由流動(dòng)相儲(chǔ)液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對(duì)其流動(dòng)相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。7第七章高效液相色譜分析一、高壓輸液系統(tǒng)1、貯液裝置2、高壓泵（輸液泵）3、過(guò)濾器4、洗脫裝置5、阻尼器7第七章高效液相色譜分析馬達(dá)往復(fù)式拉動(dòng)密封溶劑球閥脈動(dòng)阻尼器到色譜柱機(jī)械往復(fù)柱塞泵示意圖7第七章高效液相色譜分析1、貯液裝置----提供足夠數(shù)量、符合要求的流動(dòng)相，以完成分離分析任務(wù)。流動(dòng)相須經(jīng)過(guò)脫氣處理（加熱、減壓、超聲波、惰性氣體置換）。脫氣指驅(qū)除溶解在溶劑當(dāng)中的氣體。（1）脫氣是為了防止流動(dòng)相從高壓柱內(nèi)流出時(shí)，釋放出氣泡。這些氣泡進(jìn)入檢測(cè)器后會(huì)使噪聲劇增，甚至不能正常檢測(cè)。（2）溶解氧會(huì)與某些流動(dòng)相與固定相作用，破壞它們的正常功能。對(duì)水及極性溶劑的脫氣尤為重要，因?yàn)檠踉谄渲械娜芙舛容^大。2、高壓泵----輸出流動(dòng)相要求較高的輸出壓力且壓力平穩(wěn)、流速恒定、流量可調(diào)。當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)分離柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒流泵：常用7第七章高效液相色譜分析3、過(guò)濾器----對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾，以消除微小的機(jī)械雜質(zhì)。4、洗脫裝置梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。低壓梯度洗脫高壓梯度洗脫5、阻尼器----減少流動(dòng)相流量的波動(dòng)，亦稱緩沖器。7第七章高效液相色譜分析二、進(jìn)樣系統(tǒng)1、注射器（隔膜）進(jìn)樣微量注射器刺穿高分子有機(jī)硅膠墊→進(jìn)樣室由于GC系統(tǒng)壓力較小，可以直接使用；

HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進(jìn)樣（早期）。2、六通閥進(jìn)樣進(jìn)樣準(zhǔn)確、方便，進(jìn)樣過(guò)程不必停泵。3、自動(dòng)進(jìn)樣器智能軟件控制，自動(dòng)操作。7第七章高效液相色譜分析

該系統(tǒng)包括色譜柱（柱管、固定相填料、密封墊）、連接管和恒溫器等。

1、色譜柱一般長(zhǎng)度為15～50cm（需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管），內(nèi)徑為2～5mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相柱效的理論值達(dá)5000-16000/m。

2、色譜柱恒溫裝置水浴式、電熱式、恒溫箱式三、分離系統(tǒng)7第七章高效液相色譜分析

高效液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種。1、紫外檢測(cè)器（UVD）該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測(cè)。

其特點(diǎn)：1）使用面廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；2）靈敏度高（檢測(cè)下限為10-10g／ml）；3）線性范圍寬；4）對(duì)溫度和流速變化不敏感；5）可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品。四、檢測(cè)系統(tǒng)7第七章高效液相色譜分析2、示差折光檢測(cè)器（RID）凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。糖類化合物的檢測(cè)常使用此檢測(cè)系統(tǒng)。

特點(diǎn)：通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低（檢測(cè)下限為10-7g／mL），流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測(cè)。3、熒光檢測(cè)器（FD）凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測(cè)器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測(cè)定。

特點(diǎn)：其靈敏度很高（檢測(cè)下限為10-12～10-14g／mL），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測(cè)均可采用。7第七章高效液相色譜分析五、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

又稱工作站（專家系統(tǒng)），該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。7第七章高效液相色譜分析一、溶劑萃取第三節(jié)高效液相色譜分析的樣品處理方法二、微波溶劑萃取三、衍生化技術(shù)7第七章高效液相色譜分析第四節(jié)固定相和流動(dòng)相及分離方法的選擇極性固定相------硅膠、氧化鋁等非極性固定相-----活性炭、分子篩等固定相粒徑<10μm。2、液-液分配色譜固定相將固定液涂漬在（擔(dān)體）表面，形成液-液色譜的固定相。固定液與流動(dòng)相不能互溶，一般是有機(jī)液體，如聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇4000等。1、液-固吸附色譜固定相一、液相色譜固定相7第七章高效液相色譜分析3、離子交換色譜固定相4、凝膠色譜固定相（1）薄膜型離子交換樹脂（2）離子交換鍵合固定相

具有立體多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。分為軟質(zhì)、半硬質(zhì)、硬質(zhì)三種。軟質(zhì)---葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠；半硬質(zhì)---交聯(lián)聚苯乙烯凝膠；硬質(zhì)---多孔硅膠、多孔玻璃球等。7第七章高效液相色譜分析二、液相色譜流動(dòng)相（洗脫劑）

液相色譜流動(dòng)相（洗脫劑）是指各種極性、非極性液態(tài)溶劑。理想的溶劑應(yīng)有下列特性：1、所選用的流動(dòng)相溶劑要有一定的化學(xué)穩(wěn)定性，不與固定相和樣品組分起反應(yīng)，其純度和化學(xué)特性必須滿足色譜過(guò)程的穩(wěn)定性和重復(fù)性的要求。2、溶劑應(yīng)當(dāng)不干擾檢測(cè)器的工作，溶劑應(yīng)與檢測(cè)器匹配，選擇不影響檢測(cè)器正常工作應(yīng)選擇在測(cè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)吸收的流動(dòng)相。3、在制備分離中,溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去,不干擾對(duì)分離組分的回收。4、溶劑的粘度要小，保證合適的柱壓降。7第七章高效液相色譜分析5、從實(shí)用角度考慮，溶劑應(yīng)當(dāng)價(jià)格低廉，容易購(gòu)得，使用安全，純度要高。

氣相色譜的流動(dòng)相不參加色譜分離過(guò)程，而液相色譜的流動(dòng)相不僅參加分離過(guò)程，而且起著重要的調(diào)節(jié)作用，是分離分析的一個(gè)極為重要的因素。流動(dòng)相極性大小順序如下：水、甲酰胺、乙腈、乙醇、丙醇……烷烴7第七章高效液相色譜分析二、HPLC分離方法的選擇7第七章高效液相色譜分析第六節(jié)高效液相色譜儀的維護(hù)與保養(yǎng)一、高效液相色譜儀的日常維護(hù)日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要1、注意不要讓空氣進(jìn)入輸液系統(tǒng)和高壓泵中；2、儲(chǔ)液器內(nèi)的溶液如長(zhǎng)時(shí)間未用應(yīng)清洗儲(chǔ)液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈，防止無(wú)機(jī)鹽析出或沉積；3、樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì)，完全溶解，盡量減少對(duì)色譜柱的污染，以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命；4、同時(shí)避免注射過(guò)濃的樣品溶液，以免殘留液在進(jìn)樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞；色譜柱作好標(biāo)記，用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。7第七章高效液相色譜分析三、常見故障判斷與排除方法故障1流動(dòng)相內(nèi)有氣泡無(wú)法清除原因-----過(guò)濾器長(zhǎng)期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi)，過(guò)濾器內(nèi)部由于霉菌的生長(zhǎng)繁殖，形成菌團(tuán)，阻塞了過(guò)濾器，緩沖液難以流暢地通過(guò)過(guò)濾器，空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過(guò)濾器進(jìn)入流動(dòng)相。處理過(guò)濾器的方法：將其浸泡于5%硝酸溶液中，超聲清洗幾分鐘即可；亦可將過(guò)濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時(shí),輕輕震蕩幾次，再將過(guò)濾器用純水清洗幾次，即可將過(guò)濾器清洗干凈。二、色譜柱的日常維護(hù)與保養(yǎng)7第七章高效液相色譜分析故障2柱壓高原因（1）緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi);

（2）樣品污染沉積。處理對(duì)于第一種情況先用40～50℃的純水，低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降后，相應(yīng)提高流速?zèng)_洗，柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;

對(duì)于第二種情況，用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品污染的情況而定)，再用換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇正向沖洗柱子30分鐘以上。7第七章高效液相色譜分析故障3既無(wú)壓力指示，又無(wú)液體流過(guò)。

原因（1）泵密封墊圈磨損（2）大量氣泡進(jìn)入泵體。

處理對(duì)于第一種情況，更換密封墊圈；對(duì)于第二種情況，在泵作用的同時(shí)，用一個(gè)50mL的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。7第七章高效液相色譜分析故障4壓力波動(dòng)大，流量不穩(wěn)定。原因----系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物，使得兩者不能密封。

處理工作中注意觀察流動(dòng)相的量，保證不銹鋼濾器沉入儲(chǔ)液器瓶底，避免吸入空氣，流動(dòng)相要充分。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。7第七章高效液相色譜分析故障5出峰不佳，峰分叉。原因（1）色譜柱被污染;（2）柱頭填料塌陷。

處理對(duì)于第一種情況，先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品污染的情況而定)，再換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。對(duì)于第二種情況，擰開柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料)，裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。7第七章高效液相色譜分析故障6峰面積重復(fù)性不佳。原因（1）進(jìn)樣閥漏液（2）加樣針不到位。處理對(duì)于第一種情況更換進(jìn)樣閥墊圈；對(duì)于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài)，以保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確。7第七章高效液相色譜分析第七節(jié)液相色譜法的發(fā)展史

1960年代，由于氣相色譜對(duì)高沸點(diǎn)有機(jī)物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開啟了高