微生物限度檢查方法驗證課件

7-微生物限度檢查方法和驗證微生物限度檢查方法驗證

7-微生物限度檢查方法和驗證內(nèi)容介紹1.法規(guī)對微生物限度檢查法驗證的要求；2.微生物的基本知識；3.微生物限度檢查法的驗證；

4.消除供試液抑菌性的方法；

7-微生物限度檢查方法和驗證一、法規(guī)對微生物限度法驗證的要求ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證新版GMP（歐盟GMP和ICHQ7A）：12.8分析方法驗證：12.80分析方法應經(jīng)過驗證，除非采用的方法是相關的藥典或其他法規(guī)中收載的方法。然而所有測試方法的適應性應當在實際使用條件下確認，并應有文件記錄。12.82應在分析儀器/設備完成確認后，再著手分析方法的驗證。12.83對已驗證分析方法的任何修改均應有完整的記錄，這類記錄應包括修改的理由和充分的數(shù)據(jù)，以證實經(jīng)修改的方法與規(guī)定的方法同樣準確、可靠。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：前言；檢驗量；供試液制備；計數(shù)實驗的培養(yǎng)基適用性；計數(shù)實驗的方法驗證；計數(shù)實驗的操作方法；控制菌檢查的培養(yǎng)基適用性；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：控制菌檢查的方法驗證；控制菌檢查的內(nèi)容；標準體系。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：前言：前言中修訂了控制菌檢查的溫度，規(guī)定與細菌計數(shù)實驗溫度相同，均為30～35℃；（35～37℃30～35℃）前言中增訂了對于特殊品種可以最小包裝單位報告的規(guī)定。2）檢驗量：檢驗量中對要求進行沙門菌檢查的供試品，其檢驗量應增加20g或20ml的規(guī)定。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：3）供試液制備：增訂了貼劑供試品的制備方法；修訂了離心沉淀法，刪除了高速離心的規(guī)定，并對該方法的使用范圍進行了限定。10版：取一定量的供試液，500rpm離心3分鐘，取全部上清夜混合。用于細菌檢查。05版：取一定量的供試液，3000rpm離心20分鐘，棄去上清夜，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：4）計數(shù)實驗的培養(yǎng)基適用性：該部分內(nèi)容均為新增；規(guī)定了該內(nèi)容的應用范圍：細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)用的培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配置的培養(yǎng)基均應檢查。采用標準菌種計數(shù)，回收率以及形態(tài)比較的判定方法。標準菌種為：大腸埃希菌；金黃色葡萄球菌；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：4）計數(shù)實驗的培養(yǎng)基適用性：枯草芽孢桿菌；白色念珠菌；黑曲霉。規(guī)定了稀釋后的工作菌液的保存條件和保存期限：菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內(nèi)使用；若保存在2-8℃,可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2-8℃，在驗證過的儲存期內(nèi)使用。引入了對照培養(yǎng)基的概念；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：4）計數(shù)實驗的培養(yǎng)基適用性：結(jié)果判定：若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70％，且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，判定培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。5）計數(shù)實驗的方法驗證：增訂了常見干擾物的中和劑或滅活方法的參考表格；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：5）計數(shù)實驗的方法驗證：對采用多種方法仍無法得到滿意驗證結(jié)果的情況，提供了兩種方法：允許使用更高稀釋級的供試液進行方法驗證，若驗證符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級供試液進行供試品檢驗；允許選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：6）計數(shù)實驗的操作方法：平皿法刪除了應取2～3個連續(xù)適宜稀釋級供試液進行檢驗的規(guī)定；細菌培養(yǎng)時間：由48小時3天；霉菌、酵母菌培養(yǎng)時間：由72小時5天必要時延長培養(yǎng)時間：由5～7天7天。菌數(shù)報告規(guī)則進行了修訂：計數(shù)不再設置下限；以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告供試品中所含的菌數(shù)。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：6）計數(shù)實驗的操作方法：薄膜過濾法濾膜直徑調(diào)整為約50mm，并規(guī)定若采用其它直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調(diào)整；總沖洗量規(guī)定不得超過1000ml。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：7）控制菌檢查的培養(yǎng)基適用性：該部分內(nèi)容均為新增；規(guī)定了該部分內(nèi)容的應用范圍以及檢查的項目；控制菌檢查用的培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配置的培養(yǎng)基均應檢查。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：7）控制菌檢查的培養(yǎng)基適用性：采用標準菌種比較的判定方法，標準菌種包括；大腸埃希菌；金黃色葡萄球菌；乙型副傷寒沙門菌；銅綠假單胞菌；生孢梭菌；白色念珠菌。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：7）控制菌檢查的培養(yǎng)基適用性：根據(jù)培養(yǎng)基的用途不同，適用性檢查項目包括：增菌培養(yǎng)基的促生長能力；固體培養(yǎng)基的促生長能力；培養(yǎng)基的抑制能力；固體培養(yǎng)基的指示能力；液體培養(yǎng)基的指示能力。所謂促生長能力指試驗菌于被檢培養(yǎng)基，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，同對照培養(yǎng)基管比較，該控制菌應生長良好。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：7）控制菌檢查的培養(yǎng)基適用性：所謂抑制能力指試驗菌于被檢培養(yǎng)基，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長時間下培養(yǎng)，試驗菌應不得生長。所謂指示能力指試驗菌于被檢培養(yǎng)基，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應等應同對照培養(yǎng)基一致。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：8）控制菌檢查的方法驗證：刪除了陰性菌對照組的概念。9）控制菌檢查的內(nèi)容：大腸菌群的培養(yǎng)基進行了修訂，現(xiàn)改用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，05版為膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基。梭菌的增菌培養(yǎng)基修訂為梭菌增菌培養(yǎng)基，刪除了庖肉培養(yǎng)基。增訂了白色念珠菌檢查法，并增訂了與之相關的培養(yǎng)基。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證中國藥典10版同05版的主要差別：10）標準體系：菌落計數(shù)單位從“個”修訂為“cfu”；陰道、尿道給藥制劑增訂了白色念珠菌控制要求；直腸給藥制劑刪除了大腸埃希菌的控制要求。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證二、微生物的基本知識ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證什么是微生物？微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不見的微小生物的總稱。包括屬于原核類的細菌、放線菌、支原體、立克次氏體、衣原體和藍細菌（過去稱藍藻或藍綠藻），屬于真核類的真菌（酵母菌和霉菌）、原生動物和顯微藻類，以及屬于非細胞類的病毒、類病毒和朊病毒等。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證微生物特點：種類多、分布廣;迄今為止，我們知道的微生物約有10萬種，目前已知的種類只占地球上實際存在的微生物總數(shù)的20%。2.個體小、面積大;

物體的表面積和體積之比稱為比表面積，大腸桿菌的比表面積是人的30萬倍。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證3.吸收多、轉(zhuǎn)化快;

如大腸桿菌在合適條件下，每小時可以消耗相當于自身重量2000倍的糖，而人體則需要40年之久。4.適應強、易變異。微生物特點（續(xù)）：ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證三、微生物限度檢查方法的驗證ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證

微生物限度實驗室的要求：CP2010要求微生物限度檢查的環(huán)境需要滿足…，標準為GBT1629X-1996。懸浮粒子的要求：ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證微生物限度實驗室的要求：浮游菌和沉降菌：試驗區(qū)域的懸浮粒子、浮游菌和沉降菌應符合接受標準，檢測區(qū)域的環(huán)境同生產(chǎn)區(qū)一致。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證方法驗證的必要性：環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證方法驗證的流程：需前處理不需前處理有抑菌作用無抑菌作用樣品檢查去除抑菌作用①驗證前處理方法對污染菌生長、檢出的影響。③驗證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對污染菌生長、檢出的影響。②可以通過驗證實驗判斷ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證驗證什么？1.前處理；2.去除抑菌作用；3.用到的一切。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證在驗證時，應對每一試驗菌逐一驗證。

通常微生物限度檢查法驗證包括：1.細菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)方法驗證定量——回收率測定實驗2.控制菌檢查方法的驗證。定性——能否生長、專屬性實驗ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證微生物限度檢查方法：通常微生物限度檢查有兩種方法即：1.平皿法2.薄膜過濾法。兩種方法的優(yōu)缺點：平皿法：若樣品本身的混濁，會干擾計數(shù)結(jié)果；由于接種量限制，試驗靈敏度受局限；操作簡便，設備要求低。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證微生物限度檢查方法：兩種方法的優(yōu)缺點薄膜過濾法：操作復雜，設備要求高；不適用于無法溶解的樣品；大體積檢驗量，檢驗靈敏度不受局限；樣品中的抑菌因素可被濾除；中和試劑可應用在淋洗液中，如：?-內(nèi)酰胺酶；分散劑可作為溶劑，如十四烷酸異丙酯。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：當建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定。供試液的制備：通常供試液的制備分為：1.1液體供試品；1.2固體、半固體或粘稠性供試品；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：供試液的制備：1.3需用特殊方法制備供試液的供試品：1.3.1非水溶性供試品；

1.3.2膜劑供試品；1.3.3腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品；1.3.4氣霧劑、噴霧劑供試品；1.3.5貼劑供試品；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：供試液的制備：1.4具有抑菌活性的供試品：通常采用下列方法進行處理，以消除供試液的抑菌活性。1.4.1培養(yǎng)基稀釋法；取規(guī)定量的供試液至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細菌、霉菌和酵母菌的菌數(shù)時，取同稀釋級的供試液2ml，每毫升供試液可等量分注多個平皿培養(yǎng)計數(shù)。每毫升供試液所注的平皿中生長的菌落數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)。控制菌檢查時可加大培養(yǎng)基的用量。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：供試液的制備：1.4具有抑菌活性的供試品：1.4.2離心沉淀法；取一定量的供試液，500rpm離心3分鐘，取全部上清夜混合。該方法僅適用于細菌計數(shù)或控制菌（細菌）檢查。該方法只用于去除供試液中的沉淀物。采用該方法時，供試液中的樣品顆粒大小、粘稠度及污染的微生物大小等直接影響著樣品中微生物的回收，易造成檢驗結(jié)果不能真實反應供試品的污染情況。因此，供試液制備時盡量避免使用該方法，更不易采用高速離心沉降集菌。

ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：供試液的制備：1.4具有抑菌活性的供試品：1.4.2離心沉淀法；例如：小兒驚風散。本法操作較煩瑣，藥品中污染的微生物有一定的損失。1.4.3薄膜過濾法；

通常薄膜孔徑應不大于0.45um，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調(diào)整。濾器和濾膜在使用前采用適宜的方法進行滅菌。使用ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：供試液的制備：1.4具有抑菌活性的供試品：時應保證濾膜的在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試液其濾膜和濾器在使用前應充分干燥。供試液經(jīng)過濾膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml?？倹_洗量不得超過1000ml.例如：葡萄糖酸洗必泰含漱劑、氯霉素滴眼等。注意：供試液應加入較多量的稀釋液稀釋后，再注入濾器中ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：供試液的制備：1.4具有抑菌活性的供試品：1.4.4中和法；常用的中和劑或滅活方法如下：ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：1.4.4中和法；例如：①磺胺類可加對氨基苯甲酸（100ml增菌培養(yǎng)基中含1%對氨基苯甲酸0.5-1.0ml）如：復方新諾明片。②含重金屬鹽類可用含巰基化合物（硫乙醇酸鈉，L-胱氨酸）的培養(yǎng)基作增菌培養(yǎng)液。如：磺胺嘧啶銀軟膏-金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌的檢驗。③脂溶性藥物用表面活性劑中和。如：復方痔瘡栓（含洗必泰）中的綠膿桿菌的檢驗，僅用吐溫-80制備供試液即可。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：1.4.5聯(lián)合使用；適用于抑菌作用較強的中西藥制劑。如：①復方洗必泰栓（水溶性基質(zhì)）金黃色葡萄球菌的檢驗—用1%吐溫-80稀釋液制備供試液＋膜法過濾＋濾膜置含5%吐溫-80的硫乙醇酸鹽增菌液中→（+）；②生白安片（含鹽酸小檗胺）大腸桿菌檢驗—低速離心＋薄膜過濾法→（+）。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：在確定中和劑是否適用于所檢樣品及其用量時，除應證明該試劑對所檢樣品的處理有效外，還須確認該試劑不影響樣品中可能污染的微生物的檢出（即無毒性），因此無毒性試驗的菌株不能僅局限于驗證試驗菌株，而應當包括產(chǎn)品中可能污染的微生物。綜上，對于具有抑菌活性的供試品，為了消除供試品的抑菌性應盡量選擇操作簡便、快速的方法，同時所選用的方法應避免損傷供試品中污染的微生物。對于抑菌活性比較強的供試品，在供試品溶液形狀允許的情況下，應盡量選用薄膜過濾法。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：詳細的供試液的制備參見中國藥典附錄XIJ附錄107頁

微生物限度檢查法進行。

綜上，供試液制備的目的：溶解：避免讀數(shù)時的干擾；勻質(zhì)：保證檢驗樣品的代表性；消除抑菌因素：提高檢驗靈敏度。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：2.菌液制備：

2.1將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24h，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每ml含50~100cfu的菌懸液。2.2將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，24℃培養(yǎng)48h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每ml含50~100cfu的菌懸液。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：2.菌液制備：

2.3將黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，24℃培養(yǎng)5天，使大量孢子產(chǎn)生。再加入5ml含0.05％(ml/ml)聚三梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液用無菌玻棒輕輕將孢子洗脫，然后用一支管口包有無菌棉花且能過濾菌絲的10ml吸管吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05％(ml/ml)聚三梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每ml中含50~100cfu的孢子懸液。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：3.驗證方法：驗證試驗至少應進行三次獨立的平行實驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。

3.1試驗組

平皿法計數(shù)時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml和50~100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。薄膜過濾法計數(shù)時，取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50~100cfu試驗ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：3.驗證方法：

3.1試驗組

菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。

3.2菌液組

測定所加入的試驗菌菌數(shù)。

3.3供試品對照組取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：3.驗證方法：

3.4稀釋劑對照組

若供試品制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50~100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：3.驗證方法：回收率的計算：ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證計數(shù)方法的驗證：3.驗證方法：結(jié)果判斷：在3次獨立的平行試驗中，若稀釋劑對照組的菌回收率和試驗組的菌回收率均不低于70%，則驗證通過。若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證控制菌檢查方法的驗證：當建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。

1.供試液的制備同計數(shù)方法驗證時的制備方法。

2.試驗菌種，通?？刂凭鷻z查的菌種包括：大腸埃希菌；金黃色葡萄球菌；乙型副傷寒沙門菌；銅綠假單胞菌；生孢梭菌；白色念珠菌。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證控制菌檢查方法的驗證：3.菌液制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，24℃培養(yǎng)48h。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10～100cfu的菌懸液。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證控制菌檢查方法的驗證：4.驗證方法：取規(guī)定量供試液及10~100cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應控制菌檢查法進行檢查（詳見中國藥典附錄XIJ附錄111頁微生物限度檢查法）。當采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。

結(jié)果判斷：若上述試驗檢出試驗菌，則驗證通過；若未檢出試驗菌，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證控制菌檢查方法的驗證：4.驗證方法：綜上，該方法驗證沒有進行陰性菌對照試驗(也就是通常我們進行的：驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌)，因為現(xiàn)在微生物限度檢查時需要進行培養(yǎng)基的適用性檢查，該陰性菌對照試驗已經(jīng)包括在培養(yǎng)基的適用性檢查中，不在重復進行。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證微生物限度檢查方法的驗證：5.報告方法：5.1采用“平均計數(shù)×稀釋倍數(shù)”的計算或報告方法；5.2若在1:10稀釋樣品中沒有檢出，報告<10cfu/g(ml)；5.3若平均值有小數(shù)，應取整數(shù)后乘稀釋倍數(shù)，

例如：1:10稀釋樣品：平板1:1cfu；

平板2：0cfu；平均為0.5。報告結(jié)果是10cfu/ml，而不是5cfu/ml。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證微生物限度檢查方法的驗證：6.注意事項：6.1對照培養(yǎng)基系指按培養(yǎng)基處方特別制備、質(zhì)量優(yōu)良的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)基適用性檢查。由中國藥品生物制品鑒定所研制及分發(fā)。6.2進行驗證試驗時，若因沒有合適的方法消除供試品中的抑菌作用而導致微生物回收的失敗，應采用能使微生物生長的更高稀釋級供試液進行方法驗證試驗。此時更高稀釋級供試液的確認要從低往高的稀釋級進行，但最高稀釋級供試液應根據(jù)供試品應符合微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，如供試品應符合的微生物限度標準是每1g供試品細菌數(shù)不得過1000cfu，那么最高稀釋級是1X10-3。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證微生物限度檢查方法的驗證：6.注意事項：6.3用于手術(shù)、燒傷及嚴重創(chuàng)傷的局部給藥制劑應符合無菌檢查法要求，對用于創(chuàng)傷程度難以判定的局部給藥制劑，若沒有證據(jù)證明藥品不存在安全性風險，那么該藥品應符合無菌檢查法要求。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證微生物限度檢查方法的驗證：下列情況應對檢查方法進行再驗證：檢驗方法變更；培養(yǎng)基變更（包括，滅菌參數(shù)變更）；產(chǎn)品處方變更。

ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證微生物限度檢查方法的驗證：國際上微生物限度檢查方法的主要法規(guī)：USP29<61>Ph.eursupplement6th2.6.13中國藥典附錄XIJJPXVSECTION35BP2002AppendixXVIBTGAguidelines2004App17ISO14730.2ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證四、消除供試液抑菌性的方法ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證微生物檢查的主要影響因素：在藥品微生物學檢驗中，檢驗結(jié)果主要受以下因素影響，①藥品本身的抑菌性；②培養(yǎng)基的促菌生長能力；③培養(yǎng)條件(溫度、濕度及需氧或厭氧)；④過濾系統(tǒng)的材質(zhì)。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證其中抑菌因素由于其特殊的重要性而備受關注，因此在微生物檢驗方法的驗證（包括細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法、控制菌檢查和無菌實驗方法）中尤其重要，也是法規(guī)審計中的重點關注點，本部分將著重對其介紹。微生物培養(yǎng)條件也是影響供試品中菌檢計數(shù)準確與否的重要因素。應注意影響結(jié)果的兩個方面：一是培養(yǎng)基本身的性質(zhì)；二是培養(yǎng)條件。通俗說來，培養(yǎng)基應具備應廣譜性，即有助于供試品中所有存活微生物的生長。另外，應注意采用最佳培養(yǎng)條件，以確保微生物充分生長并使計數(shù)結(jié)果呈現(xiàn)良好的重現(xiàn)性。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證消除抑菌性的方法：消除藥品抑菌性常見的方法有：化學中和法、稀釋法和薄膜過濾淋洗法。根據(jù)產(chǎn)品的具體情況，也可將此三

種方法適當組合使用。

1.化學中和法當產(chǎn)品具有抑菌作用時，選用一定的化學中和劑，加入其中，以方便而快捷地中和抑菌劑，消除抑菌作用。有些化學中和劑在有效消除抑菌作用的同時，對微生物有輕微的傷害作用，這點應在驗證過程中注意。搞清產(chǎn)品是否具有抑菌作用是檢驗方法驗證的先決條件。根據(jù)檢品抑菌作用的大小和藥典的通則要求，需設計方案，通過試驗確認化學中和劑的濃度、加量及其他有關的檢驗條件。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證消除抑菌性的方法（續(xù)）：抗生素對化學抑制劑并不敏感，在無菌檢查中，應根據(jù)具體品種采用不同的酶(如青霉素酶)將抗生素活性破壞后，方能進行檢驗。這類方法均須驗證。2.消除產(chǎn)品抑菌性的第二種方法是稀釋。實驗表明，化學抑菌劑的濃度與其抑菌效果相關。不同抑菌劑在不同濃度下的抑菌作用各不相同。但對某一特定的抑菌劑來說，抑菌劑濃度與抑菌效率呈指數(shù)關系。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證消除抑菌性的方法（續(xù)）：

3.薄膜過濾法在藥品微生物學檢驗中，尤其是無菌檢查，常用薄膜過濾法來消除產(chǎn)品的抑菌性。該法基本原理是當抑菌產(chǎn)品通過濾膜時，微生物被截留在濾膜上，具有抑菌作用的藥品被過濾掉，過濾過程消除了藥品的抑菌作用。經(jīng)過濾后，將濾膜置于通常為l00ml的特定培養(yǎng)基內(nèi)，在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)，觀察其是否有微生物生長。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證消除抑菌性的方法（續(xù)）：殘留于濾膜上的抑菌劑仍有一定的抑菌作用，因此，應盡可能采用對檢品具有低吸附性的濾膜(如聚偏四氟乙烯)，以便減少抑菌作用；此外，可通過稀釋防腐劑或淋洗濾膜的方式來進一步消除殘留物的抑菌作用。所用的稀釋液或淋洗液應比較溫和，如0.1％的蛋白胨水溶液。當淋洗液中需添加化學中和劑時，要保證濾膜上的殘留物對截留在濾膜上所有微生物的生長無不良影響。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗證消除抑菌性方法的驗證：一、化學中和法

（一）試驗方法按照下列要求配置三組樣品：

1.樣品組――按照常規(guī)藥品的微生物檢驗法進行，加入抑菌中和劑，最后接入已知量的菌株(少于100個菌)，培養(yǎng)計數(shù)。2.對照組――用蛋白胨代替藥品，即以0.1%的蛋白胨溶液作為供試品，菌株接種操作同樣品組。3.菌種活性檢查組――不加抑菌中和劑，將試驗菌株直接接種培養(yǎng)。ReportedbyWangYanzhong2010.12