DB33T 2405-2021 豬德?tīng)査跔畈《竞拓i流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法　　

33浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定1豬德?tīng)査跔畈《竞拓i流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法語(yǔ)、儀器、耗材和試劑、樣品采集和處理、熒光RT-PCR操作程序、結(jié)果判定及生GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范NY/T1948獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求通則反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscription-4縮略語(yǔ)PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatePDCoV：豬德?tīng)査跔畈《荆╬orcinPEDV：豬流行性腹瀉病毒（porcineepidemicdiarrheaviru2RT-EnzymeSolution：反轉(zhuǎn)錄酶溶液（rev5.3組織研磨器或者研缽。5.5生物安全柜。5.6冰箱：可溫控在2℃~8℃和-20℃~-40℃。6.3除非另有說(shuō)明，在檢測(cè)中使用的試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。6.4Trizol：商品化RNA抽提試劑，2℃~8℃保存。）：檢測(cè)靶序列的質(zhì)粒（質(zhì)粒及其檢測(cè)靶序列見(jiàn)附錄C），陰性對(duì)照樣品為空質(zhì)粒。7.1.1手術(shù)刀、剪刀、鑷子，經(jīng)121℃濕熱滅菌30min。37.1.3組織研磨器或者研缽，經(jīng)160℃干熱滅菌2h。大豬使用保定器保定，小豬可以雙手保定，將一次性無(wú)菌采樣拭子用無(wú)菌PBS浸濕后，探入直腸2用7.1.1處理過(guò)的器械，取腸道組織（不少于5g置于無(wú)菌上述采集的樣品宜立即進(jìn)行檢測(cè)。不能立即檢測(cè)的樣品，在2℃~8℃條件下保存不應(yīng)超過(guò)24h，-25℃~-15℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)1個(gè)月，-70℃以下條件保存應(yīng)不超過(guò)6個(gè)月。樣品運(yùn)送采用低溫保肛拭子采樣管中加入500μL無(wú)菌PBS，凍融1次～2次，充分渦旋震蕩1min，于4℃下以3000r/min8.1.1按下列步驟完成RNA提取，并用無(wú)RNA酶活性的DNA酶處理，也可采用商品化的病毒RNA提取試劑8.1.2取n個(gè)滅菌的1.5mL離心管（n為待檢樣品數(shù)對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行編min。再加入200μL預(yù)冷的氯仿，震蕩混勻，靜48.1.4取與8.1.2中相同數(shù)量的滅菌1.5mL離心管，并對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行編號(hào)。取8.1.3中離心后的上清液（注意不要吸出中間層）轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，加入等體積預(yù)冷異丙醇，混勻，靜置30min。8.1.6于4℃條件下以12000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清，室溫條件下干燥后，加入30.在試劑配制區(qū)分別配制病毒檢測(cè)反應(yīng)體系和內(nèi)參對(duì)照檢測(cè)反應(yīng)體系。病毒檢測(cè)反應(yīng)管數(shù)為n+3（n為待檢樣品數(shù)，包括1份PEDV陽(yáng)性對(duì)照、1份PDCoV陽(yáng)性對(duì)照和1份陰性對(duì)照），反應(yīng)體系組成見(jiàn)下表1。內(nèi)參對(duì)照檢測(cè)反應(yīng)管數(shù)為n+2（n為待檢樣品數(shù)，包括1份內(nèi)參對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照和1份內(nèi)參對(duì)5將PCR管置于96孔板上，按順序加樣并做好標(biāo)識(shí)，轉(zhuǎn)移至核酸提在核酸提取區(qū)進(jìn)行。按照陰性、樣品RNA溶液或陽(yáng)性對(duì)照的順序加入各5.0μL溶液，蓋上蓋子，輕微震蕩混勻，以500r/min～1000r/min轉(zhuǎn)速離心30s，轉(zhuǎn)移至檢測(cè)區(qū)。檢測(cè)通道為FAM，PEDV檢測(cè)通道為Cy3；內(nèi)參對(duì)照檢測(cè)9結(jié)果判定閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性產(chǎn)品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為9.2成立條件9.2.6檢測(cè)結(jié)果判定需同時(shí)滿足9.2.1～9.2.5。否則，本次檢測(cè)無(wú)效9.3結(jié)果判定9.3.1被檢樣品檢測(cè)結(jié)果中FAM通道Ct值＜35，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為PDCoV核酸陽(yáng)性。被檢樣9.3.2被檢樣品檢測(cè)結(jié)果中FAM通道35重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果仍為可疑，報(bào)告為PDCoV核酸陽(yáng)性，否則報(bào)告為PDCoV核酸陰性。被檢樣品檢測(cè)結(jié)果中Cy3PEDV核酸陽(yáng)性，否則報(bào)告為PEDV核酸陰性。9.3.3被檢樣品檢測(cè)結(jié)果中FAM通道Ct值＞37，且無(wú)典型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為PDCoV核酸陰性。被檢樣品檢測(cè)結(jié)果中Cy3通道Ct值＞32，且無(wú)典型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為PEDV6本標(biāo)準(zhǔn)中樣品的采集、處理、保存、運(yùn)輸、檢測(cè)和廢棄物處理等涉及到的生物安全措施應(yīng)按照GB7溶液配制A.2PBS（0.01mol/L，pH785’-CGACCACATGGCTCCAATTC-3’5’-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3’5’-FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGC-ZEN-3’5’-CGCAAAGACTGAACCCACTAACCT-3’5’-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT-3’5’-CTCGATCATGAAGTGCGACGT-3’5’-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3’5’-FAM-ATCAGGAAGGACCTCTACGCCAACACGG-TAMRA-3’9(規(guī)范性)C.1質(zhì)粒圖C.1質(zhì)?；蚪M圖譜C.1.2質(zhì)粒序列TGGAGGCAAGGCCTGCAAAATGCAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAGGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGGGTCAAGTATCTCTGCTCCATCTCAGACCTCAGATTCAGGACGTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAGATACATCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAAAGGGAACTGTGGTGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGAATGGTATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTAACTCAAATCCTGCACAACAGATTCTTCATGTTTGGACCAAATCAACTTGTGATACCATGCTCAAAGAGGCCTCAATTATATTTGAGTTTTTAATTTTTATGAAAAAAAAAAACGGAATTCACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTACTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAATGATGTATTTAAATTATTTCTGAATATTTTACTAAAAAGGGGGAGGTCAGTGCATTTAAAACATAAAGAAATGAAGAGCTAGTTCAAACCTTGGGAAAATACACTATATCTTAAACTCCATGAGTGAGGCTGCAAACAGCTAATGCACATTGGCAACAGCCCCTGATGCCTATGCCTTATTCATCCCTCAGAAAAGGATTCAAGTATTGATTTGGAGGTTAAAGTTTTGCTATGCTGTATTTTACATTACTTATTGTTTTAGCTGTCCTCATGAATGTCTTTTCACTATGCTTATCCTGCATCTCTCAGCCTTGACTCCACTCAGTTCTCTTGCTTAGAGATACCACCTTTCCCCTGAAGTGTTCCTTCCTACGGCGAGATGGTTTCTCCTCGCCTGGCCACTCAGCCTTAGTTGTCTCTGTTGTCTTATAGAGGTCTACTTGAAGAAGGAAAGGGGCATGGTTTGACTGTCCTGTGAGCCCTTCTTCCCTGCCTCCCCCACTCACAGTGACCCGGAATCCCTCGACATGGCAGTCTAGTGCGGCCGCAGATCTGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGCTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGATTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTTCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGACGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGTCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGTGCCACCTGACGTGGATCCCCTGAGGGGGCCCCCATGGGCTAGAGGATCCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTCCATGAGCTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATCGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTAACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGAATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCCCTCGAAGCTTACATGTGGTACCGAGCTCGGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGATCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGTGAGATCTGAATTCTGACACTATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTGAATTGCAAGCCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCAGATTTAGCATAATGACTTAATAGGCACAGCCTTAC