DB33T 2408-2021 甘薯莖腐病菌檢疫鑒定方法　　

33DetectionandidentificationofDickeyadadantiiI請注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江省植保檢疫與農(nóng)藥管理1甘薯莖腐病菌檢疫鑒定方法綱（Gammaproteobacteria）、腸桿菌目（Enterobacterales狄克氏菌屬（Dickeya）、達(dá)旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)。革蘭氏陰性細(xì)菌，菌體短桿注：癥狀特征見附錄A。4縮略語CFU：菌落形成單位（Colony-FormingCTAB：溴代十六烷基三甲胺（CetyltrimethyDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacidNTP：脫氧核苷三磷酸（DeoxyribHR：過敏性反應(yīng)(HypersensitiveReactioionization-timeoffligNA：營養(yǎng)瓊脂（NutrientAgar）NGM：營養(yǎng)瓊脂甘油培養(yǎng)基（NutrientAgarPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymerasechainreactRT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReversetranscriptionpolymTaq：水生噬熱桿菌（Thermusaquati2根據(jù)甘薯莖腐病的菌落形態(tài)特征、田間危害癥狀特征、分子生物學(xué)PCR或RT-PCR反應(yīng)特征、蛋白質(zhì)7.18MALDI質(zhì)譜儀：需具有細(xì)菌鑒定分析3PCR擴(kuò)增RT-PCR擴(kuò)增到噴菌現(xiàn)象，剪取病健交界處3塊~5塊組后加入1mL生理鹽水，室溫浸泡15min~30min或4℃冰箱8h以上，取浸泡液12000r/min(離心力培養(yǎng)2d~3d,獲得單菌落。液10000r/min(離心力9000g)離心20min,1mL無菌水懸浮沉淀；12000r/min(離心力10000g)三次后，加入100mL生理鹽水，室溫浸泡1h或4℃冰箱8h以上，浸泡液10000r/min(9000g)離心20min,1mL無菌水懸浮沉淀，懸浮液稀釋2個~3個梯度，于NGM或NA平板涂布3個~5個平板分4樣品DNA的提取可按CTAB方法，也可使用商品化的DNA提取試劑盒提取。提取的核酸用于PCR檢測或?qū)τ谟邪Y樣品，以標(biāo)準(zhǔn)菌株做陽性對照，健康植物組織做陰性對照，雙蒸水作為空白對照進(jìn)行PCR檢測，具體檢測步驟和判定標(biāo)準(zhǔn)按附錄C執(zhí)行。單菌落可制成菌懸液直接進(jìn)行P對照為無菌水接種，保濕1d，25℃~30℃,12h/12h生長。接種2d～4d后觀察接種位置現(xiàn)癥狀。根據(jù)柯赫氏法則，對發(fā)病處組織再分離病菌，對于有癥狀樣品，PCR檢測結(jié)果為陽性，即判定為檢出甘薯莖腐病菌；無癥狀樣品或新發(fā)生區(qū)的有癥狀樣品，PCR檢測結(jié)果陽性，且分離到病菌，參考致病性測試結(jié)果，判定檢出甘薯莖腐病菌。其中，PCR檢測可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，選擇本標(biāo)準(zhǔn)10.2.2或10.2.3的一種進(jìn)行檢測，任意一種檢測方法的結(jié)果為陽性則判定為PCR檢測結(jié)果為陽性。分離的疑似甘薯莖腐病菌單菌落鑒定可選用本標(biāo)準(zhǔn)10.2.2或10.2.3或薯莖腐病菌D.dadantii。5送樣人聯(lián)系方式和聯(lián)系地址、檢測時間、地點(diǎn)、方法和鑒定者。疑似癥狀等應(yīng)及時拍照保存，PCR檢測6(資料性)A.1癥狀出現(xiàn)黑褐色斑，見圖A.1。早期發(fā)病全株枯死。中后期發(fā)病，在病斑部位上端的藤蔓有不定根深入土中吸取營養(yǎng)而使植株“假健康”,到收獲時發(fā)現(xiàn)藤蔓基部腐爛變發(fā)病斑一般以芽眼為中心圓形，稍凹陷，黑褐色，后逐漸擴(kuò)大A.2病原菌形態(tài)及培養(yǎng)性狀病原菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，菌體短桿狀，大小約為2.36μm×0.4μm,周生煙草上激發(fā)過敏性反應(yīng)(HR),見圖A.3。病原菌煎雞蛋狀，邊緣不整齊，表面略凸起，產(chǎn)生靛藍(lán)，直徑2mm~3mm,見圖A.4的右圖。7DB33/T2408—2021A-08-01LA-05-02圖A.3煙草過敏性反應(yīng)8圖A.4D.dadantii在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)A.3接種癥狀分離物10°CFU/mL菌懸液針刺接種甘薯藤蔓進(jìn)行致病性測試。對照為無菌水接種，保濕1d,25℃~30℃生長。接種2d~4d后觀察接種位置附近是否出現(xiàn)癥狀，見圖A.5。根據(jù)柯赫氏法則，對發(fā)病處組織再分離病菌，進(jìn)行PCR檢測。圖A.5甘薯藤蔓上的接種癥狀9B.2.1營養(yǎng)瓊脂（BectonDickinsonandCo），72℃延伸5min。反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)不同儀器的要求作適當(dāng)調(diào)整。