免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理-免疫學(xué)課件

湖北理工學(xué)院精品課程醫(yī)學(xué)免疫學(xué)1第一節(jié)抗原或抗體的體外檢測第二節(jié)免疫細(xì)胞的檢測第三節(jié)免疫細(xì)胞功能測定2第一節(jié)抗原或抗體的體外檢測原理：抗原抗體在體外特異性結(jié)合后，出現(xiàn)肉眼可見或借助儀器可檢測的各種現(xiàn)象，據(jù)此對樣品中的抗原或抗體能進(jìn)行定性、定量、定位的檢測。血清學(xué)反應(yīng)：進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)時，以往多采用人或動物的血清作為抗體來源，故體外的抗原抗體反應(yīng)也稱血清學(xué)反應(yīng)。一、抗原-抗體反應(yīng)的特點1、抗原-抗體反應(yīng)的特異性一種抗原通常只能與其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體結(jié)合，這種抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性稱為特異性。32、抗原-抗體反應(yīng)的可逆性非共價鍵結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物不穩(wěn)定，降低溶液的pH值或提高溶液的離子強(qiáng)度，可使抗原-抗體復(fù)合物離解（即具可逆性）。3、抗原-抗體反應(yīng)的可見性抗原與抗體結(jié)合后能否出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)取決于二者的比例和濃度。4、抗原-抗體反應(yīng)的階段性分為兩個階段，第一個是抗原-抗體特異性結(jié)合階段，其特點是反應(yīng)快，一般不能為肉眼可見；第二階段為反應(yīng)可見階段，根據(jù)參加反應(yīng)的抗原物理狀態(tài)的不同，可出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象，其特點是所需時間長，且受電解質(zhì)、溫度和酸堿度等因素的影響。4二、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素1.電解質(zhì)抗原和抗體在中性和弱堿性條件下，表面帶有較多的負(fù)電荷，適當(dāng)濃度的電解質(zhì)會使他們失去一部分負(fù)電荷而相互結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝聚團(tuán)塊或沉淀物?？乖?抗體反應(yīng)通常應(yīng)用0.85%的氯化鈉作為稀釋液，以供給適應(yīng)濃度的電解質(zhì)。2.溫度

較高的溫度可以增加抗原和抗體接觸的機(jī)會，從而加速反應(yīng)的出現(xiàn)。常用37℃水浴保溫。3.酸堿度

血清學(xué)反應(yīng)常用pH為6-8，過高或過低的pH可使抗原抗體復(fù)合物重新離解。5三、抗原-抗體反應(yīng)類型和檢測方法（一）凝集反應(yīng)：顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下（電解質(zhì)、pH、溫度等）出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)。根據(jù)抗原的性質(zhì)分為直接凝集試驗和間接凝集試驗。1.直接凝集試驗顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合并出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的稱作直接凝集試驗。按操作方法可分玻片法和試管法兩種。（1）玻片法為一種定性試驗。將含有已知抗體的診斷血清與待檢抗原懸液在玻片上混合，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)顆粒狀或絮狀凝集，即為陽性反應(yīng)。此法簡便快速，適用于新分細(xì)菌的鑒定或分型。如沙門氏菌的鑒定。也可用已知的診斷抗原，檢測待檢血清中的相應(yīng)抗體，如ABO血型鑒定。6傷寒桿菌免疫血清傷寒桿菌免疫血清生理鹽水（NS）+++大腸埃希菌傷寒沙門菌傷寒沙門菌陽性：液體變清，并有乳白色凝集塊出現(xiàn)。陰性：液體仍然混濁，無凝集塊出現(xiàn)。菌種鑒定

7不凝集（-）凝集（+）

血型鑒定AB診斷血清血型鑒定試驗結(jié)果與判定血型抗A抗BA+-B-+AB++O--89（2）試管法為一種定量試驗，用以檢測血清抗體含量。以協(xié)助疾病的診斷，如肥大反應(yīng)、外斐反應(yīng)等。

將待檢血清用生理鹽水作倍比稀釋，然后加入等量抗原，置37℃水浴數(shù)小時觀察。視不同凝集程度記錄為++++(100％凝集)、+++(75％凝集)、++(50％凝集)、+(25％凝集)和-(不凝集)。以其++以上的血清最大稀釋度為該血清的凝集價(或稱滴度)。試驗時必須設(shè)置陽性血清、陰性血清和生理鹽水等對照。102.間接凝集試驗(indirectagglutination)將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關(guān)的顆粒狀載體表面，與相應(yīng)抗體作用，在電解質(zhì)存在條件下，出現(xiàn)的特異性的凝集反應(yīng)稱為間接凝集反應(yīng)。用來檢測待檢血清中細(xì)菌、病毒、螺旋體、寄生蟲抗體及自身抗體（抗核抗體、類風(fēng)濕因子等）。

優(yōu)點敏感性高，比直接凝集反應(yīng)敏感2-8倍。常用載體用紅細(xì)胞、聚苯乙烯乳膠、活性炭等顆粒作為載體，當(dāng)載體吸附了可溶性抗原后即稱為致敏顆粒。11間接凝集抑制試驗(indirectagglutinationinhibitiontest)：將已知Ab先與被檢的可溶性Ag混合，隔一定的時間后再加入致敏顆粒，如果已知抗體與被測抗原結(jié)合，不再出現(xiàn)凝集現(xiàn)象者稱為間接凝集抑制試驗。常用與妊娠診斷，即用乳膠間接凝集抑制實驗檢測早期妊娠婦女尿中的絨毛膜促性腺激素。左側(cè)對照實驗：出現(xiàn)均勻的凝集顆粒。妊娠診斷試驗陰性：出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，即凝集未被抑制，說明待檢尿液中無HCG。妊娠診斷試驗陽性：不出現(xiàn)凝集，即凝集被抑制，說明待檢尿液中有HCG。凝集（試驗陰性）不凝集（試驗陽性）12反向間接凝集反應(yīng)：是將已知抗體吸附到載體顆粒表面，以檢測相應(yīng)可溶性抗原的凝集反應(yīng)。如檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及甲種胎兒蛋白（AFP）協(xié)助診斷乙型肝炎和原發(fā)性肝癌。3.協(xié)同凝集試驗(COAG)葡萄球菌A蛋白(SPA)能與多種動物IgG分子的Fc片結(jié)合，結(jié)合后保持其抗體活性，當(dāng)與相應(yīng)的抗原結(jié)合時，就可產(chǎn)生凝集反應(yīng)。本法廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和某些病毒的快速診斷。13（二）沉淀試驗可溶性抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在一定條件下，形成肉眼可見的白色沉淀物稱為沉淀反應(yīng)(precipitation)。參與沉淀試驗的抗原稱沉淀原，抗體稱為沉淀素?？乖梢允嵌嗵?、蛋白質(zhì)、類脂等，抗原分子較小，如細(xì)菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等。1.環(huán)狀沉淀試驗在內(nèi)徑為2-3mm的小試管底部先加入已知抗血清，然后沿試管壁緩緩加入已適當(dāng)稀釋的待測抗原于血清層上，使之成為分界清晰的兩層。數(shù)分鐘后，兩層液面交界處出現(xiàn)白色環(huán)狀沉淀，即為陽性反應(yīng)。用于法醫(yī)的血跡鑒定、昆蟲吸血性測定、炭疽病的診斷等。

142.瓊脂擴(kuò)散試驗瓊脂凝膠呈多孔結(jié)構(gòu)，孔內(nèi)充滿水分，1％瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，各種抗原抗體在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散。用瓊脂制成固體的凝膠，使抗原抗體在瓊脂凝膠中擴(kuò)散，當(dāng)二者在比例適當(dāng)處相遇形成肉眼可見的沉淀物，即發(fā)生沉淀反應(yīng)，形成肉眼可見的沉淀帶，稱為瓊脂擴(kuò)散。1516雙向雙擴(kuò)散：即用1％瓊脂澆成厚2-3mm的凝膠板，在其上打圓孔，是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測。用8%Nacl溶液制1%瓊脂糖平板，打孔（孔徑6mm周邊與中心孔距3mm）。173.對流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)

原理抗原在堿性溶液(>pH8．2)中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動，而抗體球蛋白帶電荷弱，在瓊脂電泳時，由于電滲作用，向相反的負(fù)極泳動。將抗體置正極端，抗原置負(fù)極端，電泳時抗原抗體相向泳動，在兩孔之間形成沉淀帶。瓊脂凝膠制備選用優(yōu)質(zhì)瓊脂（或瓊脂糖），濃度為1％-2％，pH通常用的巴比妥緩沖液，離子強(qiáng)度為／L，并加0.01％硫柳汞作防腐劑。18極-+極AbAgAbAbAgAg

試驗操作制備瓊脂凝膠玻板、打孔，挑去孔內(nèi)瓊脂后，將抗原置負(fù)極一側(cè)孔內(nèi)，抗血清置正極側(cè)孔。加樣后電泳30-90min觀察結(jié)果。19試驗操作制備瓊脂凝膠玻板、打孔，挑去孔內(nèi)瓊脂后，將抗原置負(fù)極一側(cè)孔內(nèi)，抗血清置正極側(cè)孔。加樣后電泳30-90min觀察結(jié)果。本法優(yōu)點

a.敏感較雙擴(kuò)散敏感10-16倍；b.快速僅需1h左右，大大縮短了沉淀帶出現(xiàn)的時間。c.用途適用快速診斷檢測。如乙型肝炎抗原的快速檢測，口蹄疫等的快速確診。2021（四）補(bǔ)體結(jié)合試驗補(bǔ)體結(jié)合試驗是應(yīng)用可溶性抗原，與相抗體結(jié)合后，其抗原抗體復(fù)合物可以結(jié)合補(bǔ)體，但這一反應(yīng)肉眼不能察覺，如再加入致敏紅細(xì)胞(溶血系)，可根據(jù)是否出現(xiàn)溶血反應(yīng)判定反應(yīng)系統(tǒng)中是否存在相應(yīng)的抗原和抗體。參與補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的抗體稱為補(bǔ)體結(jié)合抗體。補(bǔ)體結(jié)合抗體主要為IgG和IgM。通常是利用已知抗原檢測未知抗體。2223根據(jù)其產(chǎn)生的保護(hù)效果的差異，可判斷該病毒是否已被中和，并根據(jù)一定方法計算中和的程度(中和指數(shù))，即代表中和抗體的效價。

種類根據(jù)測定中方法的不同，中和試驗主要有兩種。一是測定能使動物或細(xì)胞死亡數(shù)目減少至50％(半數(shù)保護(hù)率，PD50)血清稀釋度，即終點法中和試驗。二是測定使病毒在細(xì)胞上形成的空斑數(shù)目減少至50％時血清稀釋度，即空斑減少法中和試驗。毒素和抗毒素亦可進(jìn)行中和試驗，其方法與病毒中和試驗基本相同。24第三節(jié)細(xì)胞免疫測定法a、細(xì)胞免疫體外檢測法E玫瑰花結(jié)實驗：取受試者外周血，分離淋巴細(xì)胞，與綿羊紅細(xì)胞在培養(yǎng)液中混合，在4℃2h作用后，綿羊紅細(xì)胞吸附于具有E受體的T細(xì)胞的周圍，形成玫瑰花狀的細(xì)胞集團(tuán)。臨床用于：1、細(xì)胞免疫缺陷病的診斷，原發(fā)性或繼發(fā)性細(xì)胞免疫缺陷病時，E花結(jié)形成較低；2、觀察腫瘤治療及判斷愈后；3、監(jiān)測移植排斥反應(yīng)，E花環(huán)形成百分率增高，提示排斥反應(yīng)發(fā)生。2526淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗：應(yīng)用最廣的是PHA的T細(xì)胞非特異性轉(zhuǎn)化實驗。取全血或分離的淋巴細(xì)胞，加入定量的植物血凝素（PHA）培養(yǎng)液，36℃孵育72h，涂片、染色、顯微鏡下觀察，計