《動物細(xì)胞工程習(xí)題》課件

動物細(xì)胞工程習(xí)題課程概述1細(xì)胞培養(yǎng)了解細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理和技術(shù)，掌握各種細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括原代細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞株培養(yǎng)。2細(xì)胞生物學(xué)學(xué)習(xí)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，掌握細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡的機(jī)制，以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控。3動物細(xì)胞工程技術(shù)深入研究動物細(xì)胞工程技術(shù)的應(yīng)用，包括細(xì)胞融合、基因工程、抗體工程等技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)基的組成基本營養(yǎng)物質(zhì)氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等，提供細(xì)胞生長和代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)。能量來源葡萄糖、谷氨酰胺等，為細(xì)胞提供能量和合成代謝所需物質(zhì)。生長因子胰島素、EGF等，促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖。緩沖體系碳酸氫鈉、HEPES等，維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定。細(xì)胞培養(yǎng)基的配制1計算所需成分根據(jù)細(xì)胞類型和培養(yǎng)目的，計算所需成分的量。2稱量溶解將計算好的各種成分稱量后，溶解于蒸餾水中。3調(diào)節(jié)pH值使用酸堿溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH值，使其適合細(xì)胞生長。4過濾除菌使用0.22μm的濾膜對培養(yǎng)基進(jìn)行過濾除菌。5分裝保存將滅菌后的培養(yǎng)基分裝到無菌容器中，并在低溫下保存。細(xì)胞培養(yǎng)基的滅菌1過濾除菌過濾除菌法是利用細(xì)菌無法通過的濾膜，將培養(yǎng)基中的細(xì)菌濾除2高溫滅菌高溫滅菌法是利用高溫殺死培養(yǎng)基中的細(xì)菌3紫外線滅菌紫外線滅菌法是利用紫外線照射殺滅培養(yǎng)基中的細(xì)菌原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)取材從活體組織或器官中獲取細(xì)胞。消化使用酶或機(jī)械方法分離細(xì)胞。接種將分離的細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞株培養(yǎng)技術(shù)建立穩(wěn)定的細(xì)胞株，可用于生物醫(yī)藥研究病毒、細(xì)菌、真菌等微生物培養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察和檢測動物細(xì)胞的生長曲線LagPhase細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境，生長緩慢LogPhase細(xì)胞快速增殖，數(shù)量指數(shù)增長StationaryPhase細(xì)胞增殖速率與死亡速率相等，數(shù)量穩(wěn)定DeclinePhase細(xì)胞死亡速率超過增殖速率，數(shù)量下降細(xì)胞生長相的特點(diǎn)對數(shù)生長相細(xì)胞以最大的速度生長，分裂頻率高，細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)級增長。穩(wěn)定生長相細(xì)胞生長速度減慢，新細(xì)胞的生成速率與老細(xì)胞死亡速率相等，細(xì)胞數(shù)量保持穩(wěn)定。衰退期細(xì)胞死亡速度大于新細(xì)胞生成速度，細(xì)胞數(shù)量減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞群體死亡。細(xì)胞活性檢測方法顯微鏡觀察觀察細(xì)胞形態(tài)、生長狀態(tài)，判斷細(xì)胞是否存活。染色法使用特定染料，區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，例如臺盼藍(lán)染色。酶活性檢測測量細(xì)胞內(nèi)特定酶活性，反映細(xì)胞代謝活性，例如LDH法。MTT法測細(xì)胞毒性1原理MTT是一種四唑鹽，可以被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原成紫色formazan結(jié)晶，formazan的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。2步驟將細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)后加入MTT溶液，在適當(dāng)時間后加入DMSO溶解formazan結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上測定OD值。3應(yīng)用MTT法可用于評價藥物、毒素、環(huán)境污染物等對細(xì)胞毒性作用，以及篩選藥物，研究細(xì)胞凋亡等。CCK-8法測細(xì)胞毒性原理CCK-8試劑中的WST-8在電子耦合劑的作用下，被活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原成橙黃色的formazan，其生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比。步驟1.細(xì)胞接種2.加入CCK-8試劑3.酶標(biāo)儀檢測吸光度4.計算細(xì)胞存活率。優(yōu)點(diǎn)操作簡單，靈敏度高，毒性低，適合高通量篩選。LDH法測細(xì)胞毒性原理LDH是存在于細(xì)胞質(zhì)中的酶，細(xì)胞損傷或凋亡時，LDH會釋放到細(xì)胞外。LDH在有NADH存在的情況下，可催化丙酮酸還原成乳酸，并使NADH氧化成NAD+，通過測定NADH的氧化速率來反映LDH的活性，從而間接反映細(xì)胞損傷程度。步驟1.細(xì)胞培養(yǎng)：按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，加入不同濃度的毒性物質(zhì)處理，設(shè)置對照組。2.收集細(xì)胞上清液：將處理后的細(xì)胞上清液收集，并進(jìn)行離心處理以去除細(xì)胞碎片。3.測定LDH活性：將收集到的細(xì)胞上清液加入到含有LDH底物和NADH的反應(yīng)體系中，在340nm處用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)液的吸光度變化，即可計算出LDH的活性。細(xì)胞凋亡檢測方法AnnexinV-FITC/PI法AnnexinV是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可與凋亡細(xì)胞暴露于細(xì)胞膜外的磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合，而PI則無法穿過完整的細(xì)胞膜，但可以進(jìn)入凋亡晚期或壞死細(xì)胞，從而區(qū)分不同狀態(tài)的細(xì)胞。TUNEL法TUNEL法利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)將標(biāo)記的脫氧核苷酸摻入凋亡細(xì)胞的斷裂DNA中，從而檢測凋亡細(xì)胞。Caspase-3活性檢測Caspase-3是一種重要的凋亡執(zhí)行者，其活性可通過特異性底物的熒光或比色法檢測。AnnexinV-FITC/PI法AnnexinVAnnexinV是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可與凋亡細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）結(jié)合。FITC標(biāo)記AnnexinV被熒光素異硫氰酸鹽（FITC）標(biāo)記，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。PI染色碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，可穿透細(xì)胞膜，使細(xì)胞核發(fā)出紅色熒光。TUNEL法檢測凋亡1原理TUNEL法利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)將生物素化的dUTP加入到凋亡細(xì)胞的DNA斷裂處。2應(yīng)用該方法可用于檢測細(xì)胞凋亡，并可用于評估藥物或治療的抗凋亡效應(yīng)。3優(yōu)勢TUNEL法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞周期分析方法細(xì)胞周期分析方法是研究細(xì)胞增殖和凋亡的重要手段。通過分析細(xì)胞周期各時相的細(xì)胞比例，可以了解細(xì)胞的增殖狀態(tài)和凋亡情況。常用的細(xì)胞周期分析方法包括流式細(xì)胞術(shù)和顯微鏡觀察等。PI法檢測細(xì)胞周期原理PI是一種可以與細(xì)胞核DNA結(jié)合的熒光染料，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞核DNA含量成正比。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞群中不同DNA含量的細(xì)胞比例，可以分析細(xì)胞周期的各個階段。步驟細(xì)胞收集細(xì)胞固定PI染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)電穿孔法利用電場脈沖改變細(xì)胞膜的通透性，使外源基因進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體法利用脂質(zhì)體作為載體，將外源基因包裹進(jìn)入細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒法利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組中。電穿孔法轉(zhuǎn)染細(xì)胞電穿孔利用電脈沖短暫地改變細(xì)胞膜的通透性，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞類型適用于多種細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、酵母、植物和動物細(xì)胞。效率轉(zhuǎn)染效率較高，但可能對細(xì)胞造成一定的損傷。步驟包括細(xì)胞準(zhǔn)備、DNA制備、電穿孔儀器設(shè)置和細(xì)胞恢復(fù)等步驟。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞1脂質(zhì)體包裹將外源基因包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。2細(xì)胞攝取脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合，將外源基因送入細(xì)胞內(nèi)。3基因表達(dá)外源基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)功能。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法1整合宿主基因組病毒載體將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組中2長期表達(dá)整合的基因可以長期穩(wěn)定表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)持久性的基因治療3高效轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒具有較高的轉(zhuǎn)染效率，能夠有效地將外源基因?qū)氚屑?xì)胞基因敲低實(shí)驗(yàn)siRNA干擾實(shí)驗(yàn)siRNA是由21個核苷酸組成的雙鏈RNA，它可以與靶基因mRNA結(jié)合并降解，從而抑制靶基因的表達(dá)。shRNA干擾實(shí)驗(yàn)shRNA是由19-29個核苷酸組成的短發(fā)夾狀RNA，它可以被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中并表達(dá)，從而抑制靶基因的表達(dá)。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)1siRNA的設(shè)計與合成根據(jù)靶基因序列設(shè)計并合成siRNA，確保其特異性并避免脫靶效應(yīng)。2siRNA的轉(zhuǎn)染選擇合適的轉(zhuǎn)染方法將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)染效率并降低細(xì)胞毒性。3靶基因表達(dá)量的檢測采用qPCR、Westernblotting等方法檢測靶基因的表達(dá)量，評估siRNA的干擾效果。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析分析siRNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出結(jié)論并進(jìn)行科學(xué)解釋。shRNA干擾實(shí)驗(yàn)shRNA載體shRNA載體是一種基因表達(dá)載體，可以將shRNA基因?qū)爰?xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對靶基因的抑制。干擾機(jī)制shRNA通過與靶mRNA結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA降解，從而抑制靶基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果shRNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果通常通過Westernblot、qPCR或其他方法來驗(yàn)證靶基因的表達(dá)水平。細(xì)胞免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞因子檢測ELISA,流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測細(xì)胞因子水平，了解細(xì)胞免疫反應(yīng)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)MTT,CCK-8等方法檢測細(xì)胞毒性，評估細(xì)胞免疫反應(yīng)的效應(yīng)。免疫熒光染色使用熒光標(biāo)記抗體識別細(xì)胞表面標(biāo)志物或細(xì)胞內(nèi)蛋白，觀察細(xì)胞免疫反應(yīng)。免疫熒光檢測利用特異性抗體標(biāo)記抗原，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞或組織中抗原的分布和定位。利用熒光染料標(biāo)記抗體，使抗原發(fā)出熒光，從而在顯微鏡下觀察。適用于觀察細(xì)胞內(nèi)或組織中特定蛋白的表達(dá)、定位和相互