DB50T 459-2012 草魚出血病檢疫技術(shù)規(guī)范

備案號(hào)：34907-2012DB50DB50/T459—2012草魚出血病檢疫技術(shù)規(guī)范Thenormoftechniqueforhemorrhagediseaseofgrasscarp2012-09-01發(fā)布2012-12-01實(shí)施重慶市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14檢疫方法 15無(wú)害化處理 3 4 5 6 800本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由重慶市農(nóng)業(yè)委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：重慶市魚病防治監(jiān)測(cè)中心、重慶市水產(chǎn)學(xué)會(huì)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：梅會(huì)清、李虹、曹豫、陳暢、陳玉露、翟旭亮、袁建明、宋關(guān)碧、鮑洪波、鄧婕。1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了草魚出血病檢疫技術(shù)規(guī)范的術(shù)下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括是有的修改單)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。DB50/T339水生動(dòng)物檢疫技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義由草魚出血病病毒引起的魚病。主要危害草魚、青魚。主要癥狀為病魚肌肉、腸道、鰭及鰓草魚出血病病毒GrassCarpHemorrhageVirus簡(jiǎn)稱GCHV,隸屬水生呼腸孤病毒屬(Aguareovirus)。4檢疫方法4.1臨床檢查4.1.1檢查方法4.1.1.1免疫核實(shí)經(jīng)核實(shí)檢疫對(duì)象(草魚、青魚，下同)已按規(guī)定接種了合格的草魚出血病疫苗，并處在免疫4.1.1.2群體檢查24.1.1.3個(gè)體檢查4.1.2檢查內(nèi)容群體中若有離群獨(dú)游、翻白、浮頭、活力差、攝食能力不強(qiáng)、逃避反應(yīng)弱、外觀缺損和色澤4.1.2.2個(gè)體檢查外觀檢查：觀察體色、體態(tài)和魚體不同部位的變化情況，檢疫樣本出現(xiàn)下列癥狀的疑似草魚c)體表：口腔、上下頜、頭頂部、眼眶周圍、鰓蓋、鰓及鰭條基部和腹部充血、出血，這時(shí)解剖檢查：解剖后檢查皮下肌肉和內(nèi)臟器官的變化情況，檢疫對(duì)象出現(xiàn)下列癥狀的可判定為a)皮下肌肉：剝開皮膚，肌肉呈點(diǎn)狀或塊狀充血、出血，嚴(yán)重時(shí)全身肌肉呈少；腸系膜、周圍脂肪、鰾、膽囊、肝、腎有出血點(diǎn)或血絲；個(gè)別病4.1.3臨床檢查判斷群體檢查和個(gè)體檢查中發(fā)現(xiàn)有草魚出血病的全部或部分癥狀，可作疑似草魚出血病對(duì)待，即4.2流行病學(xué)調(diào)查如發(fā)現(xiàn)疑似草魚出血病病例，應(yīng)進(jìn)行草魚出血病流行病學(xué)調(diào)查，按附錄A的要求執(zhí)行。4.3實(shí)驗(yàn)室確診4.3.1病理學(xué)檢查3午取經(jīng)臨床檢查判斷為疑似草魚出血病患病魚的新鮮組織，通過固定、作石蠟切片、午用生物顯微鏡觀察。同時(shí)，對(duì)檢疫對(duì)象的血液進(jìn)行顯微鏡檢查。根據(jù)下列病理變化，可診斷為草a)早期腸上皮細(xì)胞腫脹，杯狀細(xì)胞略有增加，固有層充血、出血，腸上皮與固有層剝離，粘膜下層也輕度充血；病變嚴(yán)重時(shí)腸上皮幾乎完全脫落，固有層級(jí)粘膜下層大量出血，肌層也有出血，腸腔中有大量紅細(xì)胞、成片的腸上皮、纖維素樣物質(zhì)病變?cè)缙跒樯?。b)各臟器小血管管壁廣泛受損，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、壞死；形成微血栓和血液淤滯，正常代謝發(fā)生障礙，臟器組織梗死樣病變。c)肝細(xì)胞發(fā)生顆粒變性、水樣變性、胞漿中糖原減少或消失，有些肝細(xì)胞的胞漿內(nèi)可看到嗜酸性包涵體；嚴(yán)重時(shí)，肝細(xì)胞發(fā)生核溶解等細(xì)胞壞死。d)紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)顯著低于健康魚。白細(xì)胞中，淋巴細(xì)胞百分率顯著低于健康魚，而中性粒細(xì)胞百分率則顯著高于健康魚。經(jīng)初步判斷為疑似草魚出血病的患病草魚，取其肝、腎、脾、腸、肌肉、血管等組織制作超薄切片，用透射電子顯微鏡觀察。如在電子顯微鏡下觀察到草魚出血病病毒粒子，可確診為草魚出血病。草魚出血病病原為草魚出血病病毒(Grasscarphemorrhagevirus,GCHV)。病毒為20面體和5:3:2對(duì)稱的球型顆粒，直徑為65nm-72nm,具雙層衣殼、無(wú)囊膜、外周為20個(gè)殼粒，核心直徑在50nm左右。經(jīng)初步判斷為疑似草魚出血病的患病魚，采用下述方法之一確診。4.3.3.1斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-E4.3.3.2葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(yàn)(SPA-COA),按附錄C的要求執(zhí)行。4.3.3.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)，按附錄D的要求執(zhí)行。5無(wú)害化處理禁止患病魚異地(塘)轉(zhuǎn)移或上市，對(duì)病死魚實(shí)施無(wú)害化處理，處理方法按DB50/T339水生動(dòng)物檢疫技術(shù)規(guī)范的要求執(zhí)行。4(規(guī)范性附錄)調(diào)查內(nèi)容免疫接種是否接種了草魚出血病疫苗，免疫程序是否規(guī)范。步排除草魚出血病。易感品種易感年齡主要是二齡以下草魚種易患草魚出血病，二齡及二齡以上草魚基本上不患草魚出血病。病。流行季節(jié)一般6月～9月，8月為草魚出血病流行高峰期。水溫在20℃~33℃時(shí)發(fā)生草魚出血病流行，流行的最適水溫為27℃~30℃:當(dāng)池塘水質(zhì)惡化，則在水溫20℃以下及33℃以上時(shí)也有發(fā)病。如果水溫在20℃~33℃時(shí)患病草魚出現(xiàn)典型質(zhì)好，水溫在20℃以下、33℃以上患病草魚出現(xiàn)典型出血癥狀，可排除草魚出血病魚病防治是否使用消毒藥物進(jìn)行草魚病的防治血病。根據(jù)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害測(cè)報(bào)結(jié)果，確定產(chǎn)地是否為草魚出血病疫區(qū)。5附錄B(規(guī)范性附錄)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)GCHV毒種取自典型自然發(fā)病的出血病病魚組織，用蔗外分光光度吸收法測(cè)定純度，并按Farrel等"的9.10D參照閔淑琴等2方法免疫大白兔，瓊脂雙向擴(kuò)散法測(cè)定抗血清效價(jià)，待滴度達(dá)到1:256左右，從頸動(dòng)脈采血制備血清，經(jīng)(NH?)?SO?沉淀后用DEAE-SephadexA50柱層析法提純IgG,紫外分光光取肝臟、腎臟、脾臟、腸道和肌肉等病變組織，經(jīng)勻漿、離心等處理后B.4Dot-ELISA測(cè)定參照Berger等8方法進(jìn)行。將孔徑0.22μm的硝酸纖維素濾膜(NCM,Amersham公司產(chǎn)品)依次浸入去離子水和TBS(0.01mol/LTris·HCl,pH7.5,0.9%NaCl)溶液各5min,然后置于帶抽濾設(shè)備的點(diǎn)樣器上，抽濾點(diǎn)樣。被檢樣品用PBS倍比稀釋，每樣品點(diǎn)25μL,37℃下干燥1h后用TBS配制的5%BSA封膜15min,然后轉(zhuǎn)入終濃度(5-10)μg/mL的兔抗GCHVIgG中，37℃下孵育1h,用TBS配制的0.05%NP-40洗滌3次，每次5min,然后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或辣根過氧化物酶標(biāo)記的A蛋白(SPA-HRP,工作濃度1:1000),37℃下作用1h,如上洗小孔片，然后置微孔測(cè)定板內(nèi)進(jìn)行，檢測(cè)中同時(shí)設(shè)正常魚組織及空白PBS等作對(duì)照。B.5結(jié)果判定6附錄C(規(guī)范性附錄)凍干葡萄球菌A蛋白(簡(jiǎn)寫SPA(+)菌)試劑，上海生物制品研究所生產(chǎn)。取感染GCRV的草魚內(nèi)臟、勻漿，以PBS10倍稀釋，凍融3次，8000r/min離心30min,上清以16000r/min離心4h,經(jīng)兩次差異離心。沉淀懸浮于少量PBS中，即基本純化的病毒抗原。-20℃保存。第一步：聚乙二醇(PEG6000)沉淀，病毒感染液8500r/min,4℃離心25min,收上清，緩緩加入40%PEG(含0.9%NaCl),使終濃度為7.5%,用1mol/LNaOH調(diào)pH值為7.5,4℃過夜，以8500r/min,4℃離心30min。收沉淀懸浮于適量PBS(pH9.0)中，于4℃過夜，然后10000r/min4℃離心10min,收上清，即為濃縮提取的病毒。緩沖液中透析48h(4℃),然后用PEG20000進(jìn)一步濃縮到一定的體積。取上述透析濃縮的病毒樣品2ml加入15%～30%蔗糖梯度溶液的頂部，25000r/min,4℃離心2h,收集病毒區(qū)帶部分。兔抗GCRV血清的制備：選2kg左右的健康家兔。將0.2mL提取的抗原和等量的完全福氏佐劑乳化液注射如淋巴結(jié)內(nèi)，即為基礎(chǔ)免疫。14天后于兩側(cè)鼠蹊皮下個(gè)注射同上計(jì)量的抗原佐劑乳化液為第二次加強(qiáng)免疫。于21天在兩側(cè)臀部肌肉各注射同上佐劑量的抗原佐劑乳化液為第三次加強(qiáng)免疫。末次注射后9天頸靜采血，得到免疫兔抗血清。用正常草魚組織經(jīng)同樣提純后的材料吸收，37℃保溫1h,4000r/min離心30min,去沉淀即特異性抗血清，滅活后-20℃保存。7為1:10。兔GCHV抗血清也可以購(gòu)買。病魚組織樣品的制備。取病魚的肝、脾、腎、腸和肌肉等組織。各按1:10(w/v)加PBS液。勻漿后，3500rpm離心30min,取上清液備用。正常魚組織按同法制備。染毒培養(yǎng)細(xì)胞樣品制備。感染病毒的細(xì)胞經(jīng)一定時(shí)間后收獲，凍融3次，3500r/min離心30min,取上清液備用。正常細(xì)胞按同法制備。C.4.1葡萄球菌體試劑的致敏。將凍干葡萄球菌菌體試劑懸浮于1mL無(wú)菌水中，加入0.1mL兔抗血清，37℃水浴溫育30min,用0.01M,pH7.2的PBS液離心洗滌3次，再懸浮于1mL同一緩沖液中，為標(biāo)記試劑待用，使用時(shí)作1:16稀釋。C.4.2測(cè)試。取待測(cè)樣品液約20μL,標(biāo)記試劑約20μL,在載玻片上用玻璃棒混勻，3min后肉眼觀察凝集反應(yīng)程度，并按下述標(biāo)準(zhǔn)作為結(jié)果判定(試驗(yàn)時(shí)設(shè)對(duì)照組):a.液體完全透明，試劑凝成粗大顆粒，即b.液體幾乎完全透明，試劑凝成較大顆粒，即75%菌體被C.5結(jié)果判定8(規(guī)范性附錄) :24:1),用力混合至少60s。12000rpm離心5min,取上層水相(約750μL)。加750μL氯仿/異戊醇(24:1),用力混合至少30s。12000rpm離心5min,取上層水相(約600μL)。加1.5倍2%CTAB配方(1.4MNaCl,20mMEDTA,100mMTris·HClpH=7.5,使用前加入總體積0.25%的模板(病毒懸液)D.3逆轉(zhuǎn)錄，加入以下體系40℃下反應(yīng)60min,再95℃下10min滅活。D.4PCR反應(yīng)體系dNTP(10mM)9 DDWTotal混勻后，在上面加50μL礦物油。短時(shí)間離心，讓礦物油在上層。94℃4min→94℃30s→57℃30s→72℃1.0min,35個(gè)循環(huán)，72℃10min→4℃保溫。反應(yīng)引物如下：GV14S6R:5'-AGTTCTCAAAGCTGAGAGV14S6F:5'-ACGTGCGATTGGAAGAGCTT-3'(320bp)GV873-M5R:5'-TTATCAGGTGCCD.5瓊脂糖核酸電泳D.5.5紫外燈下觀察核酸帶。注意膠不要太厚。不要忘記撕掉四周的膠帶。要保持EB的濃度(決定帶的亮度)、電泳液的濃度(決定帶的形狀)、瓊脂平板的平整度(決定帶是否整齊)。DNA分子量Marker用量為1μL(小孔)～1.5μL(大孔),檢測(cè)樣品用6μL(小孔)～10μL(大孔)。Taq酶和反轉(zhuǎn)錄酶最后加，并保存在-20℃。否則極易失活。2012參考文獻(xiàn)[1]中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所第三室病毒學(xué)組、武漢大學(xué)病毒研究所電鏡室.草魚出血病病原的研究一電鏡觀察.水生生物學(xué)集刊[J],1980,7(1):75-80.[2]鄭德崇.草魚出血病的電鏡觀察[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1991,15(4):317～321.[3]鄭德崇等.草魚出血病的組織病理研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào).1986,10(2):151-159.[4]邱并生.草魚出血病.微生物學(xué)通報(bào)，2011,38(6):964[5]陳燕燊.草魚出血病病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)及其理化特性的研究[J].科學(xué)通報(bào)，[6]毛樹堅(jiān).草魚出血病的病原研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1989,13(1):1-5.[7]李軍.草魚出血病病毒的研究進(jìn)展[J].海洋與湖泊，1999,30(4):445-453.[8]楊廣智.葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(yàn)快速檢測(cè)草魚出血病病毒的研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，[9]邵健忠.應(yīng)用Dot-ELISA技術(shù)檢測(cè)草魚出血病病毒的研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1996,20(1):[10]皮國(guó)華.快速ELISA的建立和應(yīng)用[J].病毒學(xué)報(bào)，1995,11(4):381-382.[11]李軍.應(yīng)用逆