動物細胞與組織培養(yǎng)干細胞

胚胎干細胞造血干細胞神經(jīng)干細胞間充質(zhì)干細胞1干細胞的有關(guān)特性一、形態(tài)和生化特征形態(tài)上通常呈圓形或橢圓形、體積小、核質(zhì)比例較大干細胞具有較高的端粒酶活性，具有較強的增殖能力二、增殖緩慢性－－利于細胞對特定的外界信號作出反應(yīng)，以決定進行增殖還是進入特定的分化程序。還可減少基因發(fā)生突變的可能性。自穩(wěn)性－－干細胞自我更新維持自身數(shù)目的恒定。這是干細胞區(qū)別于腫瘤細胞的本質(zhì)特征。2干細胞（stemcell）是一類具有自我復(fù)制能力（self-renewing）的多潛能細胞，它可以分化成多種功能細胞。根據(jù)其發(fā)育階段，可以分為胚胎干細胞和成體干細胞。根據(jù)其分化潛能的大小，可分為：①全能干細胞。它具有形成完整個體的分化潛能，可以無限制地增殖，能分化成成體的200多種細胞類型，從而可以形成任何組織和器官。胚胎干細胞屬于此類。②多能干細胞。它具有分化成多種細胞組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力，如間充質(zhì)干細胞。③定向干細胞。只能向一種或密切相關(guān)的細胞類型分化，如造血干細胞和神經(jīng)干細胞等。三、分化潛能與干細胞的種類3干

細

胞45干細胞的分裂6正常干細胞發(fā)育78胚胎干細胞胚胎干細胞包括ES細胞（embryonicstemcell）和EG細胞（embryonicgermcell）。ES細胞：當受精卵分裂發(fā)育至囊胚期，胚胎細胞在囊胚腔內(nèi)成團存在，稱為內(nèi)細胞團（innercellmass）。將細胞團的細胞分離出來進行培養(yǎng)，在一定條件下這些細胞可在體外“無限期”地增殖傳代，同時還保持其全能性。EG細胞是由原始生殖細胞（primordialgermcell,PGC）培養(yǎng)分離得到。ES是一種高度分化細胞，具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動物的所有組織和器官，包括生殖細胞。ES細胞可以在體外培養(yǎng)成為永久性細胞系，人們可以在體外對其進行各種遺傳操作，通過核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。9胚胎干細胞10胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES）是已知的分化潛能最廣的一類干細胞。胚胎干細胞的研究歷史可以追溯到1958年，Stevens等將小鼠附植體胚胎異位移植到腎臟的被膜下，得到一種能夠連續(xù)傳代的多潛能細胞系，稱為胚胎癌細胞（embryoniccarcinomacell）或畸胎瘤（teratocarcinomacell），簡稱EC細胞。胚胎干細胞系建立于1981年。英國劍橋大學(xué)的Evans和Kaufman，美國加州大學(xué)的Martin分別成功地分離和體外培養(yǎng)了小鼠的胚胎干細胞。此后，一系列其它動物的胚胎干細胞相繼分離和建系，如金黃地鼠、大鼠（1988）、豬（1990）、牛（1992）、水貂和兔（1993）等。

1995年Thomson等從恒河猴的囊胚中分離建立了世界上第一株靈長類動物的胚胎干細胞。胚胎干細胞的研究概況111998年他們在建立靈長類胚胎干細胞取得成功的經(jīng)驗基礎(chǔ)上，從接受不孕癥治療的夫婦所捐贈的處于囊胚階段的早期胚胎中分離出人的ES細胞。同年，Gearhart從選擇性流產(chǎn)所得到的胚胎生殖腺中分離出人的EG細胞。2000年，澳大利亞的Reubinoff和新加坡的體外受精專家合作，又成功地從人胚泡中建立了8株未分化的人胚胎干細胞，并在體外分化實驗中成功地得到了神經(jīng)干細胞。12胚胎干細胞的生物學(xué)特征：a．形態(tài)學(xué)特征在培養(yǎng)基中，圓形或卵圓形的細胞單層或多層堆積，呈島狀或巢狀，細胞界限不清楚；細胞體積小，核大，胞漿少，有一個或多個核仁。b．發(fā)育全能性標志具有發(fā)育階段特異性胚胎抗原（stage-specificembryonicantigen，SSEA）；堿性磷酸酶（AKP）活性較高；OCT-4基因表達，OCT-4基因是一種發(fā)育全能性的標志基因；端粒酶活性很高。13胚胎干細胞的生物學(xué)特性（P142－143）1ES細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與核型2ES細胞的生長特性3ES細胞的高度分化潛能14ES細胞的全能性表現(xiàn)：1形成畸胚瘤，將ES細胞注入同源動物皮下可形成畸胚瘤，包括三個胚層細胞。2形成類胚體，將ES細胞在非黏附底物中懸浮培養(yǎng)生長，或控制增殖細胞數(shù)目，能夠生成類胚體，是一個與畸胚瘤相似的多種系混雜的集合體，具有三個胚層組織。3直系分化，通過控制ES細胞生長環(huán)境或遺傳操縱特定基因表達，ES細胞可直接分化成某特定種系細胞。如NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)入ES細胞可分化為神經(jīng)細胞。4形成嵌合體，將ES細胞注射到同種動物囊胚腔中后，可以形成嵌合體。15ES細胞的調(diào)控ES細胞的調(diào)控是指給出適當?shù)囊蜃訔l件，對ES細胞的增殖和分化進行調(diào)控，使之向指定的方向發(fā)展。一內(nèi)源性調(diào)控1細胞內(nèi)蛋白對ES細胞分裂的調(diào)控ES細胞分裂可能產(chǎn)生新的干細胞或分化的功能細胞。這種分化的不對稱性是由于細胞本身成分的不均等分配和周圍環(huán)境的作用造成的。細胞的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是細胞骨架成分，對細胞的發(fā)育非常重要。2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控脊椎動物中轉(zhuǎn)錄因子對干細胞分化的調(diào)節(jié)非常重要。胚胎干細胞的發(fā)生中，轉(zhuǎn)錄因子OCT4是必需的。OCT4缺失突變的胚胎只能發(fā)育到囊胚期，其內(nèi)部細胞不能發(fā)育成內(nèi)層細胞團。白血病抑制因子（LIF）對培養(yǎng)的小鼠ES細胞的自我更新有促進作用，而對人的成體干細胞無作用，說明不同屬間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是不完全一致的。16二、外源性調(diào)控1分泌因子間質(zhì)細胞能夠分泌許多因子，維持干細胞的增殖、分化和存活。有兩類因子在不同組織甚至不同種屬中都發(fā)揮重要作用，即TGFβ家族和Wnt信號通路，如TGF家族中至少有兩個成員能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴干細胞的分化。Wnt的作用機制是通過阻止β-Catenin分解從而激活Tcf/Lef介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，促進干細胞的分化。2膜蛋白介導(dǎo)的細胞間的相互作用有些信號是通過細胞－細胞的直接接觸起作用的。β-Catenin就是一種介導(dǎo)細胞黏附連接的結(jié)構(gòu)成分。穿膜蛋白Notch及其配體Delta或Jagged也對干細胞分化有重要影響。3整合素與細胞外基質(zhì)整合素家族是介導(dǎo)干細胞與細胞外基質(zhì)黏附的最主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細胞的非分化增殖提供了適當?shù)奈h(huán)境。如β1整合素喪失功能時，上皮干細胞逃脫了微環(huán)境的制約，分化成角質(zhì)細胞。17ES細胞的鑒定1形態(tài)學(xué)檢測體外培養(yǎng)的ES細胞細胞形態(tài)為圓形或扁圓形，均呈單層或多層密集堆積而形成島狀、巢狀群體生長狀態(tài)。2堿性磷酸酶（AKP）活性的檢測堿性磷酸酶在早期胚胎的干細胞中含量較高，而在已分化的細胞中活性明顯降低。ES細胞表面可以檢測到特異性表面抗原（SSEA-1）,SSEA-1常作為ES細胞鑒定的一個標志。體內(nèi)分化實驗將ES細胞懸液化注射給同種動物皮下，制作切片染色可觀察到畸胎瘤的形成。185體外分化實驗

將ES細胞懸液培養(yǎng)形成囊狀簡單胚體或類胚體這類細胞多為自發(fā)分化，隨培養(yǎng)條件和細胞密度而有所不同。6核型分析主要是檢測已建立的ES細胞是否具有二倍體正常的核型，可用核型分析加以檢驗。7OCT活性檢測

OCT基因是小鼠胚胎發(fā)育早期生殖細胞譜系以及體外培養(yǎng)的多能干細胞特異性表達的一種發(fā)育全能性的標志基因。用OCT抗血清和間接免疫熒光法可檢測ES和EG細胞中OCT基因的表達產(chǎn)物。19胚胎干細胞的獲得胚胎干細胞的來源為早期胚胎內(nèi)生細胞團或原始生殖細胞。哺乳動物早期胚胎的發(fā)育屬于調(diào)整型，每個胚胎細胞都具有全能性。由胚胎細胞建立ES細胞系的原理就是將囊胚期的內(nèi)細胞團或桑椹胚在體外培養(yǎng)，并設(shè)法阻止其分化。1從早期胚胎的獲得2從原始生殖細胞中獲取2021胚胎干細胞的建系過程1ES細胞的分離獲得2ES細胞的分化抑制培養(yǎng)

抑制細胞分化的手段采用飼養(yǎng)層抑制物使用條件培養(yǎng)基3ES細胞系的建立及保存22胚胎干細胞的體外培養(yǎng)1飼養(yǎng)層培養(yǎng)法2無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法23胚胎干細胞的體外誘導(dǎo)分化1體外ES細胞誘導(dǎo)分化的優(yōu)點2ES細胞體外誘導(dǎo)分化的基本原理3ES細胞體外誘導(dǎo)分化的方法24干細胞培養(yǎng)過程2526胚胎干細胞生物學(xué)研究的一個重要領(lǐng)域是運用組織工程和基因工程技術(shù)，體外對干細胞進行誘導(dǎo)分化，可識別靶基因，發(fā)現(xiàn)新基因，并可進一步改造基因，然后用于體內(nèi)組織缺陷性疾病的細胞替代治療和基因治療，為臨床應(yīng)用開拓新途徑。這部分研究稱為干細胞工程。胚胎干細胞的應(yīng)用前景27

1

動物克隆及人類治療性克隆

ES細胞具有無限傳代增殖，且不改變其基因型和表現(xiàn)型的特點，以其作為核供體進行核移植后在短期內(nèi)可獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個體。282在轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用

利用ES細胞作為載體，體外定向改造ES細胞，使得基因的整合數(shù)目、位點、表達程度和插入基因的穩(wěn)定性及篩選工作等都在細胞水平上進行。這就容易獲得穩(wěn)定、滿意的轉(zhuǎn)基因ES細胞系。293制備嵌合體動物

利用ES細胞可以獲得具有來自兩個或多個合子體細胞的個體，即嵌合體（chimera），又叫鑲嵌體（mosaic）。嵌合體分種內(nèi)和種間嵌合體兩種。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將不同來源的重要基因轉(zhuǎn)移、組合到嵌合體中，亦即將理想性狀結(jié)合進嵌合體，使嵌合體具有多種生物學(xué)功能，甚至產(chǎn)生新的生物學(xué)功能。304、成年個體的干細胞研究成體干細胞研究是干細胞研究中最激動人心的部分。它可以有效地防止組織排斥，可以避免倫理學(xué)、法律系方面的爭論。1.成體干細胞是否具有胚胎干細胞那樣的分化潛力？

大量的動物實驗證明了成體干細胞具有很強的分化能力。如：Recentexperimentsinmicesuggestthatwhenneuralstemcellswereplacedintothebonemarrow,theyappearedtoproduceavarietyofbloodcelltypes.Studieswithratshaveindicatedthatstemcellsfoundinthebonemarrowwereabletoproducelivercells.下邊的幾個最新的研究成果進一步說明包括人在內(nèi)的高等生物的成體干細胞依然有明確的分化能力。31從成年小白鼠未發(fā)育的腦干細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧∪饧毎?/p>

AngeloVescovi和GiulioCossu,在theInstituteforStemCellResearchinMilan2000920

他們也用成年人志愿者的神經(jīng)干細胞實現(xiàn)了同樣的工作32WithASongInTheirHeads--Birthofnewbraincellsinducedinbirds

33

影響成體干細胞應(yīng)用的某些因素：

A.當前并沒有在所有人體組織中發(fā)現(xiàn)成體干細胞；

B.成體干細胞含量極少，很難分離與純化；

C.對某些病人來說，可能：疾病的進程等不到足量干細胞的培養(yǎng)；病人自身基因組有遺傳缺陷；34ES細胞研究面臨的難題1、體外培養(yǎng)ES細胞應(yīng)當是既能快速無限增殖，又呈未分化狀態(tài)。2、ES細胞高度未分化，具有形成畸胎瘤的可能性。如何誘導(dǎo)ES細胞定向分化成單一類型的分化細胞，是至今仍未解決的問題。3、ES細胞真正用于器官克隆與移植仍需要技術(shù)上的突破，因為器官的形成是一個非常復(fù)雜的三維過程，很多器官是兩個不同胚層的組織相互作用而形成的。4、最大的障礙來自倫理學(xué)，特別是ES細胞應(yīng)用受到倫理、宗教、法律以及社會因素的強烈反對，有些國家甚至明令禁止進行人類ES細胞研究。35造血干細胞（hematopoieticstemcell，HSC）主要存在于紅骨髓內(nèi)，是從胚胎卵黃囊上的血島細胞增殖、分化并遷移而來。二.造血干細胞3637造

血

干

細

胞

的

發(fā)

育38生物學(xué)特性：a.高度的自我復(fù)制能力

HSC的自我復(fù)制能力維持至正常機體的生命終結(jié)，自我復(fù)制率在正常情況下為50%，即分裂后的子代細胞只有半數(shù)保持干細胞的特征，另一半離開干細胞池進入增值分化池。如果兩者失去平衡，則會導(dǎo)致病理性造血。b.多向分化能力

HSC具有多項分化的潛能，能分化成各種血細胞。c.不均一性

HSC不是單一的細胞群體，而是由不同發(fā)育階段的干細胞組成。目前，通過各種技術(shù)純化的HSC在功能、生物物理特征和表面標志上并不完全一致，人們發(fā)現(xiàn)這些方法檢測出的造血干細胞往往不是處于同一發(fā)育階段。39HSC的研究不僅推動造血理論研究的深入，而且促進了血液病學(xué)的發(fā)展。研究證明，相當部分的再生障礙性貧血患者HSC的含量低于正常水平，提示HSC數(shù)量減少和質(zhì)量異常是再生障礙性貧血發(fā)病機制中的重要因素。目前，HSC的移植已成為治療血液病的重要手段。根據(jù)HSC的來源不同，HSC的移植可分為骨髓移植、外周干細胞移植、胚胎干細胞移植和臍HSC移植。由于骨髓中含有豐富的HSC，因此骨髓移植是臨床上最常用的HSC移植方法，用于治療一些一般治療難以奏效、且預(yù)后不良的疾病，如再生障礙性貧血、地中海貧血、白血病和急性放射病等。40近十年的研究表明，在成年哺乳動物的腦組織內(nèi)不僅存在神經(jīng)干細胞（neuralstemcell），而且還證實這些神經(jīng)干細胞在細胞因子、激素或環(huán)境因素的調(diào)控下能在體外分裂，并可進一步分化成神經(jīng)元或/和膠質(zhì)細胞。當成年腦組織或脊髓中的神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞受損后，這些干細胞能夠替代，并產(chǎn)生相應(yīng)的功能。神經(jīng)干細胞也正是因為它的生物學(xué)研究前景和臨床應(yīng)用的巨大潛力，而成為當今神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱門課題。三.神經(jīng)干細胞4142神經(jīng)干細胞通常