感染性疾病標(biāo)志物和快速診療培訓(xùn)課件

概述1.感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過(guò)不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病,主要表現(xiàn)為發(fā)熱。2.病原體：細(xì)菌（含TB）、真菌、支原體、衣原體、病毒、原蟲(chóng)等1感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025感染的診斷依據(jù)臨床表現(xiàn)：感染的全身中毒癥狀：畏寒、發(fā)熱、皮疹等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查：血常規(guī)：WBC、DC影像學(xué)檢查：X-RAY、B超病原學(xué)檢查：染色、培養(yǎng)血清學(xué)檢查：抗原或抗體檢測(cè)危重病人：臨床表現(xiàn)、WBC+DC不典型2感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025感染的分類(lèi)按病原學(xué)分類(lèi)：細(xì)菌感染（包括結(jié)核）真菌感染病毒感染支原體、衣原體按部位分類(lèi)：局部感染全身感染3感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025臨床希望第一時(shí)間知道的信息感染或非感染細(xì)菌感染或非細(xì)菌感染結(jié)核感染或普通細(xì)菌感染酵母樣真菌感染或絲狀真菌感染白色假絲酵母或其他念珠菌感染曲菌感染或毛霉菌感染因?yàn)樯鲜龈腥局委煼椒ú煌?感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025一、免疫學(xué)方法

5感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025（一）降鈣素原降鈣素原是正常人血清中存在的含116個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，最初由甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生，血清水平很低。在非感染或病毒性感染疾病時(shí)保持非常低的血清水平，在細(xì)菌性感染時(shí)含量升高，并與感染程度和預(yù)后呈正相關(guān)。PCT含量的變化穩(wěn)定，并出現(xiàn)在疾病的早期（3-4h）。短半衰期(24h)國(guó)外把PCT作為最敏感的感染標(biāo)志。6感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025降鈣素原PCT

:分子結(jié)構(gòu)血清降鈣素(CT)的前肽物質(zhì)分子量：14.5kDa由116個(gè)氨基酸組成的糖蛋白質(zhì)無(wú)激素活性11號(hào)染色體上的單拷貝基因轉(zhuǎn)錄甲狀腺濾泡細(xì)胞降鈣素原前體內(nèi)源多肽酶降鈣素原PCT分解細(xì)胞內(nèi)特殊蛋白酶正常情況下降鈣素7感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025LinscheidP,etalCritCareMed04;32:1715-21

Endocrinology03;144:5578-84&05;146:2699-708在病毒感染時(shí)，大量產(chǎn)生的IFN-

，將會(huì)抑制PCT的激活及產(chǎn)生.因此，病毒感染時(shí)，PCT的濃度將會(huì)保持在較低的水平)IL-6IL-68感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025細(xì)菌感染后PCT快速升高

Kineticsofprocalcitonininiatrogenicsepsis

BrunkhorstF.Metal,IntensCareMed1998,24:888-8929感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025PCT來(lái)源LeftLane:正常組,在不存在感染的情況下，甲狀腺外CT表達(dá)被抑制，而主要局限于甲狀腺和肺的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞有一定程度的表達(dá)RightLane:膿毒癥組,在細(xì)菌感染時(shí)可誘導(dǎo)全身各種組織多種類(lèi)型細(xì)胞CT表達(dá)和PCT連續(xù)性釋放10感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025PCT動(dòng)力學(xué)2-3h開(kāi)始增加；

6-8h快速升高；12h-48到達(dá)峰值；

2-3d正常血漿濃度在＜0.05ng/ml-1000ng/ml半衰為15-20h左右,且不受腎功能影響11感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025PCT檢測(cè)方法快速半定量法（PCT-Q）全自動(dòng)快速定量法（VIDAS)12感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025快速半定量法（PCT-Q）樣本：200μl血清/血漿結(jié)果：30min同膠體金免疫層析法，即在標(biāo)準(zhǔn)品上結(jié)合有膠體金的小鼠單克隆抗降鈣素抗體和綿羊多克隆抗降鈣素抗體，待檢標(biāo)本加上后，示蹤元素即與標(biāo)本中的PCT結(jié)合，形成一個(gè)“三明治式”的復(fù)合物，然后通過(guò)發(fā)光比色判斷PCT濃度當(dāng)PCT濃度≥0.5μg/ml時(shí)，夾心復(fù)合物呈紅色帶，顏色深淺與樣品中的PCT濃度成正比例，未結(jié)合的示蹤物擴(kuò)散到對(duì)照區(qū)，結(jié)合并產(chǎn)生了紅色的對(duì)照帶。13感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025全自動(dòng)快速定量法酶聯(lián)熒光法、化學(xué)發(fā)光法標(biāo)本要求：靜脈抗凝血注意無(wú)菌操作，使用新鮮標(biāo)本，如果4小時(shí)內(nèi)不使用，應(yīng)將標(biāo)本放置-20℃保存。血漿中的PCT非常穩(wěn)定，收集標(biāo)本24h后，PCT濃度在室溫下大約下降12％，在4℃大約下降6％14感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025PCT臨床意義細(xì)菌感染/膿毒癥診斷及嚴(yán)重程度判斷膿毒癥治療效果監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估抗生素的有效管理15感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025細(xì)菌感染診斷及嚴(yán)重程度判斷膿毒性休克嚴(yán)重膿毒癥系統(tǒng)性感染(膿毒癥)局部感染正常值

PCT的濃度隨感染的擴(kuò)散和感染嚴(yán)重程度的加重而升高16感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025膿毒癥患者治療效果及預(yù)后監(jiān)測(cè)(n=109)F.Stüber,UniversityBonn,LectureatISICEM,Brussels2001通過(guò)PCT不斷在體內(nèi)衰減，反映出抗生素治療策略的成功隨著患者對(duì)抗生素治療的響應(yīng)，引起了PCT血中濃度水平的典型變化過(guò)程AB-antibiotics17感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025抗生素有效管理PCT濃度（ng/ml）臨床意義＜0.05無(wú)細(xì)菌感染0.05-0.1非細(xì)菌感染0.1-0.25可能是局部細(xì)菌感染，不建議使用抗生素，6-24小時(shí)內(nèi)復(fù)查0.25-0.5局部細(xì)菌感染，建議使用抗生素0.5-2.0嚴(yán)重細(xì)菌感染、膿毒癥2.0-10.0重癥膿毒癥＞10.0 重度膿毒癥、膿毒性休克或MODS18感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025PCT的臨床應(yīng)用急診住院病房外科手術(shù)血液科內(nèi)科ICU外科ICU兒科急診兒科病房?jī)嚎艻CU新生兒科嚴(yán)重細(xì)菌感染或膿毒癥的檢測(cè)（鑒別診斷）疾病或治療反應(yīng)的監(jiān)測(cè)局部與全身性感染膿毒癥的診斷和監(jiān)測(cè)新生兒膿毒癥的檢測(cè)19感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025<48hr的新生兒

->生理性一過(guò)性峰值創(chuàng)傷后炎癥綜合癥:多發(fā)性創(chuàng)傷,大面積燒傷,大手術(shù)后(心臟,移植,腹部)使用致炎細(xì)胞因子治療后(OKT3,注射TNFα,IL-2,抗淋巴細(xì)胞球蛋白)某些腫瘤(甲狀腺髓樣細(xì)胞癌,肺小細(xì)胞癌和支氣管癌)長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)衰竭(心源性休克,出血性休克,熱休克)PCT水平增加但沒(méi)有系統(tǒng)細(xì)菌感染的幾種情況20感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025感染早期(->6-12小時(shí)后重復(fù)檢測(cè)!)亞急性心內(nèi)膜炎局部感染細(xì)菌感染而PCT不升高的情況21感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025

PCT檢測(cè)影響因素受以下因素影響*

甲狀腺功能

是功能性甲狀腺髓樣癌的腫瘤標(biāo)志物*

腎功能

嚴(yán)重腎功能受損者中水平較高不受以下因素影響*

類(lèi)固醇藥物*自身免疫性疾病*

年齡、性別*免疫功能低下?tīng)顟B(tài):肝硬化、HIV感染22感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025（二）細(xì)菌內(nèi)毒素革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖（LPS）和蛋白的復(fù)合物，細(xì)菌死亡或自溶后釋放進(jìn)入機(jī)體將會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、血壓降低、寒顫、引起DIC、內(nèi)毒素?cái)⊙Y等一系列臨床反應(yīng)。23感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/202524感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)原理：儀器檢測(cè)試管內(nèi)反應(yīng)物的光密度OD值，取當(dāng)OD上升到0.02的點(diǎn)的時(shí)間作為反應(yīng)時(shí)間，該點(diǎn)在反應(yīng)曲線上的位置為濁度開(kāi)始快速變化的時(shí)期，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反應(yīng)時(shí)間，從而判斷內(nèi)毒素的含量動(dòng)態(tài)濁度法25感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025儀器和試劑BET-24A細(xì)菌內(nèi)毒素分析儀

MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)26感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025標(biāo)本要求患者早上尚未進(jìn)行藥物靜脈治療時(shí):MB-80：“無(wú)熱源真空采血管”,靜脈抗凝血，采血量2-4ml，30min內(nèi)送檢BET-24A：抽取1mL靜脈抗凝血，配1mL1號(hào)處理液其它體液如腦脊液﹑胸腹水與血標(biāo)本要求相同。注意無(wú)菌操作27感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025內(nèi)毒素活性定量檢測(cè)意義G-所致膿毒癥早期鑒別診斷指導(dǎo)抗生素正確使用判定抗感染治療效果幫助判斷患者的預(yù)后28感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025內(nèi)毒素定量檢測(cè)的適應(yīng)癥各種急、慢性病理性發(fā)熱患者各種類(lèi)型“中重度感染、肝病、休克、腸道疾病、臟器功能衰竭、大手術(shù)術(shù)后”患者慢性疾病長(zhǎng)期臥床、免疫力低下患者急診及ICU病房收治的生命體征不穩(wěn)定的患者29感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/20251.1,3-β-D-葡聚糖-G試驗(yàn)1，3-β-D-葡聚糖是酵母和絲狀真菌細(xì)胞壁的多聚糖成分，以假絲酵母菌屬含量最高，而其他微生物動(dòng)物及人的細(xì)胞成分和細(xì)胞外液都不含這種成分。因此，血液及無(wú)菌體液中檢出1，3-β-D-葡聚糖在很大程度上可以視為IFI的標(biāo)志，如念珠菌、曲霉、鐮刀霉、酵母和絲孢酵母感染等。目前的檢測(cè)方法為G試驗(yàn)，其原理是1，3-β-D-葡聚糖有特異性激活鱟變形細(xì)胞裂解物中的G因子引起裂解物凝固，故稱(chēng)為G試驗(yàn)。國(guó)內(nèi)已經(jīng)使用微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。30感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025標(biāo)本要求采樣過(guò)程要求無(wú)菌操作常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血取樣（血透患者透析前采血）標(biāo)本類(lèi)型：抗凝靜脈血，使用無(wú)熱原真空采血管采血量：2-3ml，立即混勻半小時(shí)內(nèi)送檢。實(shí)驗(yàn)前未打開(kāi)標(biāo)本在2-8℃可保存5天。打開(kāi)后標(biāo)本需在48小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。如需長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，存儲(chǔ)溫度應(yīng)為-70℃。血清標(biāo)本最多可凍融四次。解凍標(biāo)本檢測(cè)之前要充分混勻31感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025G試驗(yàn)的臨床意義早期、快速診斷侵襲性真菌感染可用于真菌感染早期篩查，適用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、鐮刀菌、地霉、組織胞漿菌和毛孢子菌等，不能用于檢測(cè)隱球菌和接合菌感染。對(duì)真菌感染癥狀進(jìn)行診斷，陽(yáng)性結(jié)果代表存在侵襲性真菌感染32感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025（三）半乳甘露聚糖(GM)半乳甘露聚糖(GM)是一種對(duì)熱穩(wěn)定的水溶性的物質(zhì)，是廣泛存在于曲霉和青霉細(xì)胞壁中的一類(lèi)多糖。一般在曲霉感染者出現(xiàn)臨床癥狀和影像學(xué)檢查異常前數(shù)天，其體內(nèi)循環(huán)中GM即可呈陽(yáng)性表達(dá)，其靈敏度和特異度均可達(dá)到80%以上。原理：是一種微孔板雙抗體夾心法，采用小鼠單克隆抗體EBA-2，檢測(cè)人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖。33感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025標(biāo)本要求標(biāo)本采集：靜脈采血5ml（紅帽管）。檢測(cè)標(biāo)本：血清標(biāo)本，密封，無(wú)菌操作。實(shí)驗(yàn)前未打開(kāi)標(biāo)本在2-8℃可保存5天。打開(kāi)后標(biāo)本需在48小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。如需長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，存儲(chǔ)溫度應(yīng)為-70℃。血清標(biāo)本最多可凍融四次。解凍標(biāo)本檢測(cè)之前要充分混勻20mg/L膽紅素，或2g/L甘油三酯的脂血，或165mg/L血紅蛋白的溶血標(biāo)本不影響檢測(cè)結(jié)果34感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025GM試驗(yàn)臨床意義1.診斷侵襲性真菌感染2.血清GM檢測(cè)能區(qū)分侵襲性肺曲霉感染與白色假絲酵母菌、毛霉、肺炎鏈球菌感染和煙曲霉口咽定植。但不能區(qū)分曲霉菌種。3.評(píng)價(jià)療效的可靠指標(biāo)35感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)提高對(duì)IFI的診斷。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可達(dá)100%。36感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025其它新生隱球菌：循環(huán)夾膜抗原是新生隱球菌病,尤其是新生隱球菌腦膜炎的診斷手段。乳膠法:5min即可出結(jié)果,特異性達(dá)90-100%,可檢測(cè)35ng/ul的抗原ELISA:敏感性高于LA(乳膠凝集),可檢測(cè)6ng/ul37感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025（四）結(jié)核分枝桿菌的快速診斷結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。估計(jì)世界人口中1/3感染結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，一般需2-4周長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的落菌?？顾崛旧ㄊ菣z測(cè)TB的傳統(tǒng)方法，但存在假陽(yáng)性因此，快速診斷對(duì)TB至關(guān)重要。38感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025結(jié)核感染現(xiàn)狀全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情急劇惡化結(jié)核病與艾滋病同時(shí)流行結(jié)核菌耐藥現(xiàn)象益發(fā)嚴(yán)重人口大規(guī)模流動(dòng)我國(guó)是世界上僅低于印度的第二結(jié)核病大國(guó)結(jié)核菌感染率44.5%新發(fā)活動(dòng)性結(jié)核患者130萬(wàn)/年死亡13萬(wàn)/年早期快速診斷與治療成為制約結(jié)核病控制的關(guān)鍵常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核病方法陽(yáng)性率不到60%39感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025全球結(jié)核疫情40感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025結(jié)核檢測(cè)方法一、現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)技術(shù)細(xì)菌學(xué)診斷─涂片、培養(yǎng)免疫學(xué)診斷─抗原、抗體膠體金分子生物學(xué)診斷─PCR二、其它檢測(cè)技術(shù)結(jié)核菌素純蛋白衍生物PPD（TST）實(shí)驗(yàn)影像學(xué)檢查41感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025

結(jié)核夾層杯技術(shù)結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)核分枝桿菌的快速診斷42感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025結(jié)核夾層杯技術(shù)原理：通過(guò)專(zhuān)用消化滅活液消化組織細(xì)胞和粘蛋白等，將結(jié)核桿菌裸露出來(lái)，并結(jié)合高速震蕩，使痰標(biāo)本充分液化而有利于其中的抗酸桿菌沉淀于特制彭氏杯底部的菌膜上，在夾層杯中直接抗酸染色、干燥，并用取片針頂出內(nèi)底，經(jīng)封片等步驟后，鏡下檢測(cè)抗酸桿菌。43感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025檢測(cè)流程示意圖44感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025鏡下比較圖2.夾層杯法（新方法）：

菌量多，背景清晰，易于觀察

圖1.直接涂片法（傳統(tǒng)方法）：菌量少，背景不清晰45感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025夾層杯診斷技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)陽(yáng)性率高背景清晰，易于觀察易于標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)速度快生物安全性好夾層杯診斷技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)46感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025結(jié)核夾層杯技術(shù)標(biāo)本要求：（1）痰液要求新鮮，留取清晨深咳出的第一口痰液，留痰時(shí)，患者以清水漱口３次，然后用力咳出氣管深處的痰（2）用氫氧化鈉處理完全。臨床應(yīng)用：用于結(jié)核分枝桿菌的初篩47感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)是以ELISPOT技術(shù)

檢測(cè)結(jié)核感染的新方法

，ELISPOT是近20年發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞的技術(shù)，是目前最敏感的檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞的方法之一。48感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA，interferon-gammareleaseassay）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT，Enzyme-LinkedImmunoSpotassay）結(jié)核桿菌特異抗原早期抗原靶6（ESAT-6）earlysecretedantigenictarget6培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP10）culturefiltrateprotein10）技術(shù)背景49感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時(shí)會(huì)分泌多種細(xì)胞因子（IFN-γ）。因此，檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于效應(yīng)T細(xì)胞存活時(shí)間很短，而且具有特異性，因此可以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無(wú)論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理的檢測(cè)項(xiàng)目目前已被美國(guó)、加拿大、英國(guó)、德國(guó)、意大利、瑞士、法國(guó)、荷蘭、日本等二十余個(gè)國(guó)家寫(xiě)入本國(guó)的結(jié)核診療指南中γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA）50感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）51感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）近二十多年來(lái)，隨著技術(shù)改良，ELISPOT分析技術(shù)已經(jīng)是當(dāng)世公認(rèn)的最靈敏的抗原特定T細(xì)胞的體外檢測(cè)技術(shù)結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA技術(shù)），能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況，靈敏度高。其技術(shù)原理：用抗體捕獲培養(yǎng)中細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色方式將其表現(xiàn)出來(lái)（SedgwickJD2005）。52感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025結(jié)核桿菌特異抗原ESAT-6與CFP10抗原由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)53感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025操作步驟①②54感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025操作步驟⑤⑥④③孵育1小時(shí)55感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025實(shí)際效果圖陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果空白對(duì)照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽(yáng)性對(duì)照（PHA）56感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025T-SPOT.TB特點(diǎn)特異性好，不受卡介苗（BCG）接種和環(huán)境分枝桿菌影響靈敏度高，在免疫力低下/受抑制人群中有很高的檢出率快速，24小時(shí)報(bào)告結(jié)果57感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025寫(xiě)入診療指南的國(guó)家（Guidelines）美國(guó)（CDC和兒科學(xué)會(huì)）；加拿大（加拿大結(jié)核病委員會(huì)）；巴西（衛(wèi)生部）英國(guó)（國(guó)家衛(wèi)生和臨床協(xié)會(huì)）；法國(guó)（國(guó)家衛(wèi)生局）；西班牙（西班牙肺病和胸部手術(shù)協(xié)會(huì)）；德國(guó)（德國(guó)抗結(jié)核病中央委員會(huì)）；意大利；瑞士（瑞士肺科協(xié)會(huì)）；荷蘭（實(shí)用結(jié)核病控制委員會(huì)）；丹麥（丹麥肺部醫(yī)學(xué)會(huì)）；挪威（挪威公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)）；芬蘭（國(guó)家衛(wèi)生和福利協(xié)會(huì)）；愛(ài)爾蘭（國(guó)家結(jié)核病咨詢委員會(huì)）；葡萄牙；捷克共和國(guó)；斯洛伐克；波蘭；保加利亞；克羅地亞澳大利亞（國(guó)家結(jié)核病咨詢委員會(huì)、傳染病協(xié)會(huì)和澳大利亞風(fēng)濕病協(xié)會(huì)）；沙特阿拉伯；南朝鮮；日本（日本結(jié)核病預(yù)防協(xié)會(huì)）

WHO和ECDC中國(guó)（專(zhuān)家組推薦）58感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/20251、結(jié)核病輔助診斷/療效評(píng)價(jià)“菌陰”結(jié)核病患者的輔助診斷肺外結(jié)核的鑒別診斷抗癆治療的療效評(píng)價(jià)2、免疫力低下/受抑制患者的結(jié)核診斷/感染篩查使用生物制劑/免疫抑制劑患者的結(jié)核感染篩查HIV感染者/腎透析患者/器官移植患者3、兒童結(jié)核病的輔助診斷4、結(jié)核密切接觸者/高危人群的結(jié)核感染篩查結(jié)核病患者的家屬/醫(yī)務(wù)工作者/監(jiān)獄囚犯5、接觸追蹤臨床應(yīng)用59感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025結(jié)核相關(guān)疾病肺結(jié)核菌陽(yáng)（痰涂片、痰培養(yǎng)）------結(jié)核專(zhuān)科醫(yī)院菌陰------感染科、呼吸科、胸外科、結(jié)核科肺外結(jié)核淋巴結(jié)結(jié)核------外科、血液科、感染科結(jié)核性胸膜炎------感染科、呼吸科、結(jié)核科結(jié)核性腹膜炎------外科、消化科、感染科結(jié)核性腦膜炎------感染科、神經(jīng)科骨關(guān)節(jié)結(jié)核------骨科、風(fēng)濕科、感染科泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核------泌尿外科、腎臟科、感染科、性病科其他：如結(jié)核性心包炎、脾結(jié)核、胰腺結(jié)核等60感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025評(píng)價(jià)不能夠提示臨床患者的病變部位不能夠根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)量的多少來(lái)判斷受試者是活動(dòng)性結(jié)核病患者或是潛伏感染者兒童結(jié)核的輔助診斷，需要結(jié)合臨床61感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025(五)熒光抗體技術(shù)

常用于呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等微生物抗原/抗體快速檢查。直接法、間接法。常用熒光染料：異硫氰酸熒光素（FITC）、四乙基羅丹明（RIB200）、藻紅蛋白（PE）、稀土鑭系元素等。62感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025

1.直接熒光抗體法熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。直接熒光抗體染色法示意圖

63感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025

病毒抗原檢測(cè)1.標(biāo)本收集和處理由專(zhuān)職護(hù)士將塑料導(dǎo)管經(jīng)鼻腔插入7-8cm達(dá)到咽部以下誘導(dǎo)吸取1-2ml分泌物,洗滌標(biāo)本，離心，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞濃度到1.0×106/ml。2.

免疫熒光染色（Chemicon試劑）

用直接免疫熒光試劑對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。熒光顯微鏡下觀察。檢測(cè)多種病毒：腺病毒（ADV）、流感病毒A(IFVA)、B型(IFVB)、副流感病毒1、2、3型(PIV1、2、3)及呼吸道合胞病毒(RSV)。標(biāo)本送到實(shí)驗(yàn)室2h內(nèi)就可得出結(jié)果,普通實(shí)驗(yàn)室即可開(kāi)展，特異性達(dá)86%，敏感性達(dá)95%。。64感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

間接熒光抗體染色法示意圖2.間接熒光抗體法65感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025

(1)呼吸道病原體IgM抗體檢測(cè)西班牙Vircell生物公司生產(chǎn)的呼吸道感染病原體IgM九聯(lián)檢測(cè)卡可早期、快速、準(zhǔn)確地檢出引起呼吸道感染的主要病原體的IgM抗體。檢出的病原體包括：嗜肺軍團(tuán)菌血清Ⅰ型、肺炎支原體、Q熱立克次體、肺炎衣原體、肺炎支原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。66感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025九項(xiàng)呼吸道感染病原體IgM抗體檢測(cè)試劑盒

67感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025

(2)載玻片結(jié)合抗原含有下列抗原：1.嗜肺軍團(tuán)菌血清1型（懸浮于0.5%正常雞卵黃囊中以增強(qiáng)抗原吸附性和避免細(xì)菌聚集）2.McCoy細(xì)胞中的肺炎支原體3.Q熱立克次體II期（懸浮于0.5%正常雞卵黃囊中以增強(qiáng)抗原吸附性和避免細(xì)菌聚集）4.肺炎衣原體（原生小體）5.HEp-2細(xì)胞中的腺病毒6.HEp-2細(xì)胞中的呼吸道合胞病毒7.LLC-MK2細(xì)胞中的甲型流感病毒8.LLC-MK2細(xì)胞中的乙型流感病毒9.LLC-MK2細(xì)胞中副流感病毒1、2和3型10.質(zhì)控孔。68感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/202569感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025

（3）九聯(lián)檢的檢測(cè)價(jià)值特點(diǎn)：1.取材方便：空腹采集非抗凝靜脈血3ml。2.檢測(cè)全面：一卡九項(xiàng)，避免漏檢；3.靈敏度≥93.8%，特異性≥96.3%，性能穩(wěn)定，無(wú)交叉反應(yīng)；4.IgM抗體一般1-2周出現(xiàn)；2-3月消失。不能區(qū)分特別早期及重復(fù)感染。臨床意義：

呼吸道感染性疾病的早期、快速、準(zhǔn)確診斷；

對(duì)病原體的鑒別診斷提供導(dǎo)向性依據(jù)；

指導(dǎo)臨床合理用藥。

70感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/202571感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/202572感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025（三）酶聯(lián)免疫技術(shù)

1.GM試驗(yàn)：檢測(cè)人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖，用于侵襲性曲霉菌感染輔助診斷。2.斑點(diǎn)ELISA技術(shù)：?jiǎn)慰寺】贵w結(jié)合硝酸纖維膜，檢測(cè)患者的咽拭標(biāo)本中肺炎支原體、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒等病原體。73感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025

二、分子生物學(xué)技術(shù)74感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025分子診斷技術(shù)檢測(cè)致病菌PCR技術(shù)擴(kuò)增16srRNA基因鑒定常見(jiàn)致病菌革蘭陽(yáng)性球菌革蘭陰性桿菌mecA基因VanA/VanB基因PBP2b基因PCR擴(kuò)增耐藥基因特異性基因ESBLs基因AmpC基因碳青霉烯酶基因mecA：耐甲氧西林葡萄球菌屬（MRS）特異性基因VanAVanB

：耐萬(wàn)古霉素腸球菌（VRA）特異性基因PBP2b

：青霉素不敏感肺炎鏈球菌（pNSSp）特異性基因ESBLs基因：主要包括TEM、SHV、CTX-M、OXAAmpC基因包括質(zhì)粒介導(dǎo)型和染色體誘導(dǎo)型。其中前者主要包括MOX、CMY、DHA、ACC、ACT、FOX等亞型，后者主要包括：ADC。碳青霉烯酶基因：A類(lèi)酶，以KPC為代表；金屬酶，以IMP、VIM、NDM為代表；D類(lèi)酶，以O(shè)XA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-48為主。75感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025（一）DNA分子中G+C百分含量的測(cè)定

遺傳物質(zhì)DNA中四種堿基G、C、A、T的排列和比例是DNA特性的決定因素。細(xì)菌DNAG+C或A+Tmol%能反映細(xì)菌間DNA分子同源程度。不同種屬間G+Cmol%范圍在25%-75%之間。同一種細(xì)菌G+Cmol%相當(dāng)穩(wěn)定，不受菌齡、培養(yǎng)條件和其他外界因素影響,成為細(xì)菌分類(lèi)和菌種鑒定的重要指標(biāo)。親緣關(guān)系越近的細(xì)菌G+Cmol%越相近，但G+Cmol%相同或近似，其親緣關(guān)系不一定相近。常用方法：熱變性溫度法、高效液相色譜法、浮力密度法和熒光法。76感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025

（二）DNA-DNA雜交

原理：基于DNA解鏈的可逆性和堿基配對(duì)的專(zhuān)一性，將不同來(lái)源的DNA在體外變性（高溫或pH)，并在合適的條件下(鹽類(lèi)濃度和溫度），使互補(bǔ)的堿基重新配對(duì)，測(cè)量雜交百分?jǐn)?shù)。常用方法：固相雜交法。將待測(cè)菌株雙鏈核酸解成單鏈固定在硝酸纖維素濾膜等固相支持物上，置入含有經(jīng)標(biāo)記的并解鏈的參照菌株的單鏈核酸(探針)液中復(fù)性，形成新的雙鏈核酸，測(cè)定雜合雙鏈的相對(duì)放射性強(qiáng)度來(lái)確定菌株間的同源性程度。同一菌：100%同源性。同一種內(nèi)同一亞種的細(xì)菌：80%-90%同源性。同一種內(nèi)不同亞種的細(xì)菌：60%-70%同源性。同一屬中的不同菌種的細(xì)菌：20%-60%同源性。77感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025（三）核酸擴(kuò)增技術(shù)

1985年發(fā)明PCR技術(shù)。常用檢測(cè)方法：逆轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR、巢式PCR、通用引物PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、隨機(jī)引物DNA多態(tài)性擴(kuò)增、限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。目的基因包括16SrRNA、23SrRNA、16S-23SrRNA基因間隔區(qū)、熱休克蛋白基因、膜蛋白基因、DNA解旋酶B亞基的gyrB基因、細(xì)菌毒力基因等。16SrRNA、23SrRNA及16S-23SrRNA序列應(yīng)用最為廣泛。78感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/20251.16SrDNA鑒定

細(xì)菌的rRNA按沉降系數(shù)分可分為5S、16S和23S三種，其編碼基因(rDNA)的鏈長(zhǎng)依次為120bp、1540bp和3300bp。20世紀(jì)60年代末，Woese等學(xué)者開(kāi)始采用寡核苷酸編目法對(duì)生物進(jìn)行分類(lèi)，通過(guò)比較各類(lèi)生物細(xì)胞的rRNA特征序列，認(rèn)為16srRNA及其類(lèi)似的rRNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)最為合適。79感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/20251.16SrDNA鑒定

16SrDNA是細(xì)菌染色體上編碼16SrRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中，它們相對(duì)穩(wěn)定且有較高的拷貝數(shù)，其序列中含可變區(qū)及高度保守區(qū)，因此可設(shè)計(jì)群、屬、種特異性的探針。16SrDNA測(cè)序:細(xì)菌基因組DNA提取、16SrDNA特異引物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測(cè)序、序列比對(duì)等步驟。采用探針雜交或PCR等方法檢測(cè)血液、腦脊液等無(wú)菌體液中16SrRNA基因,即表明有細(xì)菌感染。16SrDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量較少，對(duì)于親緣關(guān)系較近的細(xì)菌，其分辨率不高，16SrDNA序列分析只能在屬的水平上區(qū)分細(xì)菌，仍然需要借助其他手段加以輔助分析。80感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/202516SrRNA具有多拷貝多信息的特點(diǎn)81感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/20252.16s-23srDNA鑒定

16S-23SrDNA區(qū)間序列的進(jìn)化速度是16SrDNA的10倍。16S、23SrDNA端序列高度保守?？捎糜诰N間的鑒別,還可以用來(lái)分辨16SrDNA不能鑒別的非常接近的菌種和種內(nèi)細(xì)菌之間的鑒別82感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/20253.核酸探針技術(shù)

原理：用帶有酶、化學(xué)熒光物、放射性核素或生物素標(biāo)記的已知序列特定DNA片段，稱(chēng)為探針。在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則探針與待測(cè)標(biāo)本中的核酸雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)，從而鑒定標(biāo)本中有無(wú)相應(yīng)的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探針技術(shù)：液相雜交、固相雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交、Southern印跡、Northern印跡等。核酸探針可檢測(cè)任何特定病原微生物，目前已廣泛用于常見(jiàn)病毒感染的診斷和研究.83感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/20254.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（1）LAMP技術(shù)來(lái)源：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)。

1）2000年日本學(xué)者NotomiT等首先報(bào)道一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。

2）針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用1種鏈置換聚合酶，在恒溫條件(60-65℃)保溫約60min即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，還可通過(guò)設(shè)計(jì)兩條環(huán)引物可使反應(yīng)速度提升l/2～l/3。

3）LAMP技術(shù)可用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等病原微生物的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)、戰(zhàn)時(shí)野外、食品化妝品安全及基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用。

84感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025（2）擴(kuò)增原理DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。在鏈置換型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2區(qū)段的3’末端為起點(diǎn)，與模板DNA互補(bǔ)序列配對(duì)，啟動(dòng)鏈置換DNA合成。85感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/202586感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/202587感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025（3）檢測(cè)方法熒光定量法：利用SYBRGreenI熒光染料只與雙鏈DNA小溝結(jié)合，當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出較原先強(qiáng)800～1000倍的熒光的原理，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。獲取Ct值，比照標(biāo)準(zhǔn)曲線，可確定模板DNA的起始拷貝數(shù)。顏色變化：產(chǎn)物中加SYBRGreenI或Goldview，肉眼觀察顏色反應(yīng)；呈綠色的為陽(yáng)性反應(yīng)，橙紅色為陰性反應(yīng)。濁度檢測(cè)：在核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀。肉眼觀察或濁度儀在400nm光下，檢測(cè)沉淀濁度就能夠判斷擴(kuò)增與否。

88感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025（4）LAMP試驗(yàn)缺陷與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳觀察等過(guò)程，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、低價(jià)等特點(diǎn)。缺點(diǎn)：1.引物設(shè)計(jì)比傳統(tǒng)的PCR復(fù)雜，為單鏈DNA的分離增加了難度。2.LAMP為定性試驗(yàn)，且只能檢測(cè)一種細(xì)菌，無(wú)法提供藥敏信息。3.反應(yīng)的條件需要摸索：引物的長(zhǎng)度與濃度、反應(yīng)條件、目的序列的大小、莖環(huán)結(jié)構(gòu)的大小等方面進(jìn)行優(yōu)化，提高擴(kuò)增效率和特異性。4.LAMP反應(yīng)易污染，最好分區(qū)操作。89感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025三、生物傳感器

生物傳感器利用生物化學(xué)和電化學(xué)反應(yīng)原理，將生化反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，通過(guò)對(duì)電信號(hào)進(jìn)行放大和模數(shù)轉(zhuǎn)換，測(cè)量出被測(cè)物質(zhì)及其濃度。固定化的生物敏感材料作識(shí)別元件（包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì)）與適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器（如氧電極、光敏管、場(chǎng)效應(yīng)管、壓電晶體等等）及信號(hào)放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)。由于生物傳感器檢測(cè)準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、高度自動(dòng)化、微型化與集成化的特點(diǎn)，近年來(lái)已經(jīng)在感染性疾病診斷、藥物篩選、生物武器監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用。檢測(cè)病原體的DNA生物傳感器最為常見(jiàn)，監(jiān)測(cè)多種細(xì)菌、病毒及其毒素，如炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶爾森菌、埃博拉出血熱病毒、SARS病毒、肉毒桿菌類(lèi)毒素等。90感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025生物傳感器按所用分子識(shí)別元件的不同按信號(hào)轉(zhuǎn)換元件的不同按對(duì)輸出電信號(hào)的不同測(cè)量方式酶?jìng)鞲衅魑⑸飩鞲衅鹘M織傳感器細(xì)胞傳感器免疫傳感器DNA傳感器

電化學(xué)生物傳感器半導(dǎo)體生物傳感器測(cè)熱型生物傳感器測(cè)光型生物傳感器測(cè)聲型生物傳感器電位型生物傳感器電流型生物傳感器伏安型生物傳感器91感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025微生物傳感器

微生物傳感器由固定化微生物、換能器和信號(hào)輸出裝置組成,利用固定化微生物代謝消耗溶液中的溶解氧或產(chǎn)生一些電活性物質(zhì)并放出光或熱的原理實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)的定量測(cè)定,原理見(jiàn)下圖：微生物傳感器原理示意圖92感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025SchematicdiagramofBODmonitoringsystemforanaerobicwastewatertreatmentprocess93感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025影響傳感器響應(yīng)的因素1）PH值：微生物傳感器中細(xì)菌生長(zhǎng)于轉(zhuǎn)換器電極要求的PH值不一致時(shí)，需要找出一個(gè)折衷值2）緩沖溶液的種類(lèi)和用量：Tris緩沖液可產(chǎn)生氨，而焦磷酸鹽緩沖液對(duì)微生物有抑制作用，這兩種緩沖液均不能用于用氨氣敏電極作為轉(zhuǎn)換器而組成的組氨酸微生物傳感器。另外緩沖劑的緩沖容量不足時(shí)也會(huì)造成電極不符合能斯特響應(yīng)。3）微生物的用量：增加細(xì)菌細(xì)胞的用量可使能斯特響應(yīng)區(qū)增寬，但增加得太多又會(huì)導(dǎo)致響應(yīng)減慢，而且傳感器浸泡在緩沖液恢復(fù)到原來(lái)響應(yīng)值的時(shí)間也相應(yīng)增長(zhǎng)。4）溫度：微生物傳感器雖也要求最適溫度，但不像酶電極那樣敏感。適當(dāng)提高溫度可使細(xì)菌細(xì)胞新城代謝以及底物的擴(kuò)撒加快，從而使響應(yīng)時(shí)間縮短。5）活化劑與穩(wěn)定劑6）氣體的影響94感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025四、生物芯片

生物芯片是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。以玻片、尼龍膜等為載體,將大量基因片段、多肽、蛋白質(zhì)等探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷虾笈c帶熒光標(biāo)記的DNA、蛋白質(zhì)或小分子等進(jìn)行雜交，檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸、蛋白質(zhì)及其他生物成分的高通量快速檢測(cè)。病原微生物感染的快速診斷、變異及耐藥機(jī)制的研究；基因分型、分子流行病學(xué)調(diào)查和抗感染藥物的研制等。制備成本高，檢測(cè)儀器昂貴，特異性、敏感性有待進(jìn)一步提高等因素,目前還未在臨床病原微生物檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。95感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025

生物芯片基本類(lèi)型生物芯片biochip芯片實(shí)驗(yàn)室分析生物芯片DNA芯片蛋白質(zhì)芯片細(xì)胞芯片組織芯片labonchip生物計(jì)算機(jī)芯片蛋白質(zhì)計(jì)算機(jī)芯片DNA計(jì)算機(jī)芯片biocomputeranalyticalbiochip96感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025五、質(zhì)譜分析技術(shù)

質(zhì)譜法

(massspectrometry,MS)：是在高真空系統(tǒng)中將樣品分子離解成帶電的離子，并通過(guò)對(duì)生成離子的質(zhì)量和強(qiáng)度的測(cè)定，而進(jìn)行樣品成分和結(jié)構(gòu)分析的方法。應(yīng)用：1.適用于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，包括蛋白質(zhì)/肽質(zhì)量指紋譜測(cè)定，多肽序列分析等研究；2.適用于臨床微生物快速準(zhǔn)確鑒定。97感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025研究者時(shí)間

貢獻(xiàn)J.JThomson1912第一臺(tái)質(zhì)譜儀GohlkeandMcLafferty1956氣相質(zhì)譜Biemann,Seibletal.1959肽序列分析McLafferty,Jenningsetal.1967串聯(lián)質(zhì)譜McLafferty1973液相質(zhì)譜ComisarowandMarshall1974傅立葉回旋共振質(zhì)譜Barber,Bordolietal.1981快原子轟擊Yamashita,Fennetal.1984電噴霧離子化用于生物大分子Tanaka,Karasetal.1988基質(zhì)輔助激光解吸離子化用于生物大分子質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展歷史簡(jiǎn)介98感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025

99感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025MALDI-TOFMS技術(shù)1.不同屬種的細(xì)菌具有不同的蛋白指紋圖譜，根據(jù)細(xì)菌蛋白指紋圖譜可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行快速鑒定。

2.1996年，Claydon等采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOFMS）鑒定革蘭陰性和革蘭陽(yáng)性細(xì)菌。

3.激光照射樣品與基質(zhì)（α-氰基-4-羥基肉桂酸，CHCA)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程是將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過(guò)程。離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道到達(dá)檢測(cè)器，被測(cè)離子的飛行時(shí)間與離子的質(zhì)荷比與成正而達(dá)到檢測(cè)目的；再通過(guò)專(zhuān)用軟件分析比較，確定出病原菌特征性的指紋圖譜，質(zhì)量范圍為2-20KDa。每種微生物都有自身獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成，因而擁有獨(dú)特的蛋白質(zhì)指紋圖譜。100感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025MALDI-TOF:基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析法(MS)VITEKMSMicroflex101感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025MALDI-TOFMS概述

(MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlight)解吸附離子化加速分離檢測(cè)離子檢測(cè)器++++++靶板基質(zhì)/樣本結(jié)晶加速場(chǎng)飛行時(shí)間102感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025MALDI-TOFMS:基本原理標(biāo)本分子與基質(zhì)形成基質(zhì)/標(biāo)本結(jié)晶invacuum<10-7TorrTimeofFlight103感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025TimeofFlightMALDI-TOFMS:基本原理激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過(guò)程。

104感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025MALDI-TOF質(zhì)譜分析法分析2,000到20,000道爾頓蛋白檢測(cè)150-200個(gè)質(zhì)量峰20-30個(gè)蛋白與數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論核糖體蛋白直接匹配其他質(zhì)量峰為未知蛋白(有可能是修飾后的核糖體蛋白)105感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025MALDI-TOFMS

通過(guò)模式匹配進(jìn)行鑒定樣本譜參考譜完美匹配:各峰之間無(wú)距離次完美匹配:各峰之間存在一定距離106感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析VITEKMS:AdvancedSpectraClassifierusingaweightedbinmatrix

（先進(jìn)的利用加權(quán)Bin矩陣的光譜分析儀）BrukerBiotyperVITEKMS107感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌氟勞地枸櫞酸桿菌Bin1Bin2Bin3Bin5Bin4…..Bin13000+200+4-15-3金黃色葡萄球菌VITEKMS–Bin矩陣的發(fā)展 =>每個(gè)Bin的權(quán)重: ++:高度菌種特異性(+15,+20….) +:中度菌種特異性(+3,+4….) -:無(wú)峰(-3,-4….) --:無(wú)峰或者質(zhì)量峰對(duì)應(yīng)其他菌種(-15)108感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025VITEKMS–從質(zhì)量分布到Bin矩陣Peaks12345678910…………...….129812991300Bins12345678910………………S1S2S3S1S2S312345678910………………+++++++++++++Presence/Absence109感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025Bin1Bin2Bin3Bin4Bin5Bin1300Abiotrophiadefectiva00+4+150+4Acinetobacterhaemolyticus0-3+40+40Acinetobacterjohnsonii0-3000+4Acinetobacterjunii00+40-30E.Coli+15-8+3000S.aureus0+200-15

+4

-3Salmonellagroup+13-11+40-20………………………每一臺(tái)商品化VITEKMS都使用Bin矩陣

每次數(shù)據(jù)庫(kù)更新都會(huì)對(duì)Bin矩陣進(jìn)行更新………...…ProbabilitycurvesVITEKMS–Bin矩陣的發(fā)展110感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025111同Bin矩陣比對(duì)為所有菌種計(jì)算bin值(score)將Bin值轉(zhuǎn)換為置信度發(fā)送結(jié)果從譜圖獲取到結(jié)果報(bào)告的全自動(dòng)化VITEKMS–結(jié)果計(jì)算111感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025VITEKMS(IVD)基于種群SARAMIS(RUO)基于菌株BrukerBioTyper質(zhì)譜–不同的數(shù)據(jù)分析理念基于種群菌種之間的差異得到了體現(xiàn)需要使用很多參考菌株基于單個(gè)菌株建庫(kù)快菌株并不可代表很多常見(jiàn)分離株112感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025標(biāo)本準(zhǔn)備的簡(jiǎn)單步驟掃描標(biāo)本序列號(hào)掃描測(cè)試靶板–顯示空靶點(diǎn)將病原菌放在測(cè)試靶板上，并添加基質(zhì)掃描VITEK2藥敏卡VITEKMS:pendingFDAclearance113感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025靈活性:多個(gè)操作臺(tái)(可達(dá)10個(gè))盡可能單獨(dú)放置每批檢測(cè)可以分析1–4張靶板高通量:4x48=192標(biāo)本/測(cè)試節(jié)省大量時(shí)間:無(wú)需進(jìn)行各種測(cè)試

多張芯片可以允許進(jìn)行不同測(cè)試VITEKMS簡(jiǎn)化的操作流程WorkStation1WorkStation2WorkStation3WorkStation4VITEKMS:pendingFDAclearance114感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025一次性測(cè)試靶板條形碼可溯源每個(gè)測(cè)試靶板有3個(gè)測(cè)試區(qū)每組1–16個(gè)樣本每個(gè)區(qū)域有校準(zhǔn)孔驗(yàn)證操作正確性(調(diào)整、對(duì)齊等)無(wú)需清洗VITEKMS測(cè)試靶板115感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025產(chǎn)氣腸桿菌DSM30053在三種不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24小時(shí)之后的譜圖所有樣本都具有主要特征峰所有培養(yǎng)基上的樣本都得到了正確鑒定培養(yǎng)基對(duì)鑒定沒(méi)有影響對(duì)各種培養(yǎng)基兼容116感染性疾病標(biāo)志物和快速診療1/17/2025在哥倫比亞培養(yǎng)基上的奇異變形桿菌DSM4479譜圖經(jīng)