醫(yī)學(xué)碩士研究生開(kāi)題報(bào)告范文3

導(dǎo)師XX教授

研究生XX五、預(yù)期目標(biāo)六、已具備條件和個(gè)人條件七、前期工作基礎(chǔ)（可行性）八、研究工作的主要階段、進(jìn)度和完成時(shí)間九、經(jīng)費(fèi)預(yù)算十、實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)及前景分析

三立論依據(jù)和國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.脊髓損傷嚴(yán)重威脅人們的健康和生活質(zhì)量，被視為臨床治療的難題。脊髓損傷后的修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的一大難題。近年來(lái)神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)研究為脊髓損傷的治療提供了一種新的策略。2.膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中除神經(jīng)元外的另一類細(xì)胞成分。數(shù)量上膠質(zhì)細(xì)胞遠(yuǎn)多于神經(jīng)元，有報(bào)道CNS內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的數(shù)目之比為10：1～50：1。星形膠質(zhì)細(xì)胞約占正常成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總數(shù)的40％。星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞的作用不僅僅是保護(hù)、營(yíng)養(yǎng)和支持，還參與血－腦屏障的構(gòu)成、水的轉(zhuǎn)運(yùn)、遞質(zhì)的代謝和釋放、離子平衡的維持等[6~8](VanDcGraaff,1998;SulyoklE,2004;朱長(zhǎng)庚.神經(jīng)解剖學(xué))。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）是構(gòu)成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要細(xì)胞骨架蛋白，其表達(dá)的高低可以反映膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)[9](BiginiP,2001)?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GFAP的增高，可能起保護(hù)神經(jīng)元的作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞在損傷區(qū)分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，以促進(jìn)中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)軸索的生長(zhǎng)和存活[10](JCdelaTorre,2002)。很多研究表明PCD存在于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的多個(gè)環(huán)節(jié)[11](NaruseI,1995)，從未分化的神經(jīng)上皮到遷移后的有絲分裂后細(xì)胞，從神經(jīng)管的形成[12](李澤桂,1999)到神經(jīng)元與靶區(qū)的匹配都有PCD發(fā)生，凡不能與靶區(qū)正確匹配和參與正常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的神經(jīng)元均通過(guò)PCD加以清除[13](HommaS,1994)。

配制方法：封閉用正常血清原液可用PBS或TBS稀釋成5-10%（即1：10-1：20倍稀釋）后使用。3％H2O2

廠家：天津市化學(xué)試劑三廠批號(hào)：050905

配制方法：30%H2O250ml

+

蒸餾水450mlNestin、NeuN、GFAP抗體

Nestin：Chemicon公司（批號(hào)MAB5326)

NeuN：Chemicon公司（批號(hào)MAB377）

GFAP：Upstate公司（批號(hào)07－650）－20

℃冰箱保存，稀釋后4℃保存PV－9000免疫組化試劑盒

廠家：中杉公司

Lot:509102-8℃保存DAB顯色液（ZLI-9032）批號(hào)：13861842-8℃保存PBS緩沖液檸檬酸鹽修復(fù)液TUNEL－POD試劑盒廠家：Roch公司批號(hào)：4.2儀器或設(shè)備：(1)高壓鍋:廠家：潮安縣順發(fā)五金制品有限公司批號(hào)：xk16-203-00048(2)顯微鏡:廠家：Olympus

批號(hào)：XS-212-201(3)LX-100手掌型離心機(jī)廠家：江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠(4)HT-200微量電子天平廠家：成都善瑞遜電子有限公司(5)LX-100手掌型離心機(jī)廠家：江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠3.實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟（1）取材（2）固定（3）制作石蠟切片Ⅰ放入包埋盒中已固定好的組織用自來(lái)水沖洗24小時(shí)（為了把甲醛除去）；Ⅱ脫水；Ⅲ透明；Ⅳ浸蠟；Ⅴ切片：切成5μm厚的切片；Ⅵ貼片：載玻片經(jīng)過(guò)防脫片處理。Nestin、NeuN、GFAP免疫組化步驟：1.石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化：二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→無(wú)水乙醇10min→95％乙醇5min→90％乙醇5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min→蒸餾水Ⅰ3-5min→蒸餾水Ⅱ3-5min。2.抗原修復(fù)：（1）高溫高壓抗原修復(fù)：取適量的檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）于壓力鍋中（緩沖液的量必須能足夠浸沒(méi)整個(gè)切片）放置于電磁爐上加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫染色架上，放入已沸騰的緩沖液中。蓋上鍋蓋扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽，扣閥至噴汽以4-6min為佳。時(shí)間到，壓力鍋離開(kāi)熱源。稍置數(shù)分鐘后，用自來(lái)水沖淋使之冷卻，去閥開(kāi)蓋，室溫放置20min。自然冷卻后取出切片。（2）微波抗原修復(fù)取適量檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）于燒杯中放入微波爐里加熱至沸騰，將脫蠟

后置于耐高溫切片架上的切片放入沸騰的檸檬酸緩沖液中繼續(xù)加熱10min即可，取出燒杯，室溫中通風(fēng)處放置20～30min。自然冷卻后取出切片。3.用0.01MPBS沖洗2-3min→3%H2O2去離子水浸泡10min（以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性）→PBS沖洗3次，每次5min。4.5％羊血清室溫下封閉30分鐘。5.甩去羊血清，不洗，直接在切片組織上滴加適量稀釋的抗體（Nestin、NeuN、GFAP一抗），置于4℃冰箱過(guò)夜。切片置于濕盒中。6.次日上午把切片從冰箱中取出，先在室溫中放置30min（以使切片適應(yīng)室溫）。7.0.01MPBS沖洗3次，每次5min。除去PBS（用力甩去）。每張切片上加一滴試劑1（中杉公司的免疫組化試劑盒PV-9000），室溫下孵育20min。8.0.01MPBS沖洗3次，每次5min。除去PBS。切片上滴加試劑2（PV-9000），室溫下孵育30min。細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)的步驟：采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒1.石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。2.新鮮配制3%H2O2，室溫處理15min。0.01M

PBS液洗滌5min×3次。3.切片上滴加消化液（10mMTris-Hcl

995ul加入1mg/mlProteinaseK新鮮稀釋至5ug/ml）,37℃消化20min，0.01MPBS洗5min×3次。4.新鮮配制通透液，4℃孵育20min或室溫孵育8min。0.01MPBS洗5min×3次。

通透液：取20XSSC20ul，TritionX-1004ul（45℃-50℃預(yù)熱），加單蒸水3.98ml，定容至100ml，充分均勻。5.標(biāo)記甩去切片上多余液體，標(biāo)本片擦干組織及周邊水分，按每張切片滴加1液和2液（1：9，混合均勻）配成TUNEL反應(yīng)混和液（冰上操作）。陰性對(duì)照組只加入試劑2液，而不加1液。標(biāo)本上覆蓋塑料蓋片，置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記1h，后4℃過(guò)夜。（20h以上）。0.01M

PBS洗5min×3次。6.滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫中30min，甩掉封閉液，不洗。

7.轉(zhuǎn)化劑—POD50μl/片滴加至標(biāo)本片上。置樣品于濕盒中，37℃孵育40min.0.01MPBS洗5min×3次。8.DAB顯色，室溫5-10min。單蒸水中止顯色，流水沖洗10min。9.脫水，透明，封片。八研究工作的主要階段、進(jìn)度和完成時(shí)間1.實(shí)驗(yàn)所需標(biāo)本已制作完成2.2007.11－2008.1開(kāi)始做預(yù)實(shí)驗(yàn)及正式實(shí)驗(yàn)3.2008.1－2008.4觀察結(jié)果，圖像分析統(tǒng)計(jì)，撰寫論文九經(jīng)費(fèi)預(yù)算1.nestin、NeuN、GFAP三個(gè)抗體價(jià)格Anti-NeuN：3437.50元（chemicon公司）Anti-nestin：3000元（chemicon公司）Anti-GFAP：3737.50元（Upstate公司）2.免疫組化試劑盒第二代通用型二步法檢測(cè)系統(tǒng)（北京中杉公司，PV-9000）320.00元/3.0ml3.細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（TUNEL）

Roche公司4600元4.封閉用正常羊血清（原液）（北京中杉公司，ZLI－9020）45元/10ml2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期不符這就要求我們從標(biāo)本固定取材開(kāi)始直至后續(xù)的免疫組化染色和原位凋亡細(xì)胞的檢測(cè)都嚴(yán)格操作，不忽視每一個(gè)環(huán)節(jié)、每一個(gè)步驟。試劑準(zhǔn)備充分，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，實(shí)驗(yàn)操作熟練、準(zhǔn)確，努力將實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)控制到最小程度。[5]ConradAM,JeanH,JoanWB.Analysisofthetemporalexpressionofnestininhumanfetalbrainderivedneuronalandglialprogenitorcells[J].DevelopmentalBrainResearch,2002,134(1－2):87-92.[6]VanDcGraaff,KentM.Humatnanatomy.UnitedStatesofAmerica;TheMcGrawHillCompanies,1998.340-345.[7]SulyoklE,VajdaZ,DocziT,etal.Aquaporinsandthecentralnervoussystem.ActaNeurochir,2004,146(9):955-960.[8]朱長(zhǎng)庚.神經(jīng)解剖學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.400-407,1033-1046.

[9]BiginiP,BastoneA,MenniniT.Glutamatetransportersinthespinalcordofthewobblermouse[J].Neuroreport，2001.12(9):1815.[10]JCdelaTorre.Alzheimer‘sdisease:howdoesitstart?

JAlzheimersDis，2002,4（6）:497～512.[11]NaruseI,KeinoH.ApoptosisindevelopingCNS.ProgressinNeurobiology，1995,47(2):135～155[12]李澤桂，蔡文琴，陳活彝.神經(jīng)管發(fā)生與程序性細(xì)胞死亡.解剖科學(xué)進(jìn)展，1999,5(3)