3-2-基因工程的基本操作程序(第2課時(shí))

第二節(jié)基因工程的基本操作程序1、植物目的基因的導(dǎo)入方法2、動(dòng)物目的基因的導(dǎo)入方法3、微生物目的基因的導(dǎo)入方法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）花粉管通道法（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①轉(zhuǎn)化②農(nóng)桿菌的特點(diǎn)③轉(zhuǎn)化過(guò)程④受體細(xì)胞1、植物目的基因的導(dǎo)入方法（1）花粉管通道法我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的方法，其受體細(xì)胞為受精卵。方法如下：方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；方法二：在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。子房花粉柱頭花粉管精子卵細(xì)胞胚囊（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法②農(nóng)桿菌的特點(diǎn)a.能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。③轉(zhuǎn)化過(guò)程T-DNA目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中④受體細(xì)胞a、體細(xì)胞。可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，通過(guò)植物組織培養(yǎng)再生成植株。b、受精卵。可以將花序直接浸沒(méi)在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。2、動(dòng)物目的基因的導(dǎo)入方法受體細(xì)胞為受精卵。導(dǎo)入方法通常為顯微注射法。獲得的重組細(xì)胞一般需要通過(guò)早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植獲得個(gè)體。3、微生物目的基因的導(dǎo)入方法Ca2+處理大腸桿菌使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中感受態(tài)細(xì)胞吸收1、目的與意義2、檢測(cè)與鑒定3、小結(jié)四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、目的與意義目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過(guò)檢測(cè)與鑒定才能知道，這也是檢查轉(zhuǎn)基因是否成功的一步。2、檢測(cè)與鑒定類型檢測(cè)內(nèi)容方法分子水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個(gè)體是否具有相應(yīng)性狀病原體接種實(shí)驗(yàn)等3、小結(jié)獲取質(zhì)粒、噬菌體等載體篩選和獲取目的基因用限制酶切割載體和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA連接酶連接，構(gòu)建基因表達(dá)載體將含有目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞檢測(cè)和鑒定目的基因是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性目前，基因工程已經(jīng)步入產(chǎn)業(yè)化發(fā)展階段，具有巨大的生產(chǎn)力和發(fā)展?jié)摿Γ覀冊(cè)诔錆M信心和期待的同時(shí)，還要嚴(yán)格規(guī)范操作流程，科學(xué)、客觀地評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，只有這樣，才能讓基因工程永葆生機(jī)?；蚬こ痰幕静僮髁鞒虉D到社會(huì)中去1.在實(shí)際種植過(guò)程中，棉鈴蟲(chóng)是否對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性？證據(jù)是什么？科研人員對(duì)長(zhǎng)江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種的抗蟲(chóng)性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護(hù)所，靶標(biāo)害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)、紅鈴蟲(chóng)等并未對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國(guó)、澳大利亞、印度等國(guó)的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，通過(guò)毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個(gè)高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種。到社會(huì)中去2.科研工作者在沒(méi)有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對(duì)。他們想出的延緩棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？科研人員想出的延緩棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個(gè)方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)性和抗蟲(chóng)持久性。包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個(gè)殺蟲(chóng)基因、構(gòu)建組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子、提高殺蟲(chóng)基因的表達(dá)量等。例如，最早種植的抗蟲(chóng)棉中只轉(zhuǎn)入了一種Bt基因，抗性比較單一；現(xiàn)在經(jīng)常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時(shí)轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞，這樣既可以提高殺蟲(chóng)活性，又可以延緩害蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生和發(fā)展，還可以通過(guò)不同基因間的互補(bǔ)作用擴(kuò)大抗蟲(chóng)范圍。到社會(huì)中去2.科研工作者在沒(méi)有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對(duì)。他們想出的延緩棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？（2）田間策略。這是在種植時(shí)采取的措施，如提供庇護(hù)所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國(guó)等地普遍采取的措施是在轉(zhuǎn)基因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲(chóng)劑的非轉(zhuǎn)基因棉花，或在轉(zhuǎn)基因棉田周圍種植20%～30%面積的可使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑的非轉(zhuǎn)基因棉花；在印度，一些地區(qū)要求，在轉(zhuǎn)基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉(zhuǎn)基因棉花。我國(guó)除新疆棉區(qū)及大型農(nóng)場(chǎng)需設(shè)計(jì)專門的庇護(hù)所外，其他棉區(qū)如長(zhǎng)江、黃河流域棉區(qū)多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉與番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉鈴蟲(chóng)寄主作物混作)，這些作物可以構(gòu)成天然的庇護(hù)所，一般無(wú)須種植非轉(zhuǎn)基因棉花作為庇護(hù)所。這樣做的原理是為少部分害蟲(chóng)提供一個(gè)正常的取食環(huán)境，始終保持一定的敏感目標(biāo)害蟲(chóng)種群。這樣，即使目標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生了抗性，但是因?yàn)槠渑c敏感目標(biāo)害蟲(chóng)交配，后代抗性基因會(huì)發(fā)生分離，所以抗性目標(biāo)害蟲(chóng)的種群也不至于迅速增加。到社會(huì)中去2.科研工作者在沒(méi)有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對(duì)。他們想出的延緩棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？（3）國(guó)家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實(shí)施分區(qū)種植管理、加強(qiáng)抗性監(jiān)測(cè)、進(jìn)行嚴(yán)格的安全生評(píng)價(jià)等。1、原理2、材料試劑3、方法步驟4、注意5、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)探究﹒實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1、原理利用PCR可以在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增。PCR利用了DNA熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1、原理DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定2、材料試劑①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定2、材料試劑⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無(wú)菌水。⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等⑧PCR反應(yīng)體系的配方DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5ul20mmol/l的4種脫氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l的引物I2.5ul20umol/l的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul的TaqDNA聚合酶1-2U模板DNA5-10ul總體積50ul注：模板DNA的用量為1pg-1ugDNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3、方法步驟（1）配反應(yīng)液。用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書，在微量移液管中依次加入各組分。（2）離心。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3、方法步驟（3）設(shè)置PCR反應(yīng)程序。參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性940C，5min————30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1minDNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3、方法步驟制備瓊脂糖膠。（4）根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。（5）將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。（6）待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3、方法步驟（7）倒電泳液。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜。（8）點(diǎn)樣。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。（9）電泳。接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓，一般為1-5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。（10）觀察記錄。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定4、注意（1）為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。（2）該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。（3）在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。（4）在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定5、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（1）你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度