儀器分析第十二章復(fù)習(xí)

1儀器分析InstrumentalAnalysis色譜概論

IntroductionofChromatography沈昊宇，haoyushen2000@163.com22008年9月講課內(nèi)容：《儀器分析》之色譜法罪魁禍?zhǔn)祝?/p>

“假蛋白”

三聚氰胺

(Melamine)

C3H6N6

沈昊宇，haoyushen2000@163.com3結(jié)石機理J.Am.Chem.Soc.2001,123,7518-7533沈昊宇，haoyushen2000@163.com4色譜技術(shù)為什么會被添加？含氮量高、不易被發(fā)覺為什么不易被發(fā)覺？檢測方法有漏洞如何來檢測？沈昊宇，haoyushen2000@163.com5沈昊宇，haoyushen2000@163.com6沈昊宇，haoyushen2000@163.com7我們做過的綠色植物中色素提取的實驗綠色植物中色素的分離應(yīng)用的就是色譜技術(shù)基本過程：菠菜剪碎研細(xì)→石油醚/甲醇混合液提取→分液→濃縮→上柱分離（柱中裝中性氧化鋁，石油醚/丙酮混合液洗脫）

固定相流動相

什么是色譜技術(shù)？沈昊宇，haoyushen2000@163.com8

色譜分離的基本過程沈昊宇，haoyushen2000@163.com9載氣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)溫控系統(tǒng)進樣系統(tǒng)高壓輸液裝置分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)

認(rèn)識常用的儀器GCSystem沈昊宇，haoyushen2000@163.com101906年Tswett創(chuàng)立“chromatography”—“色譜法”新名詞。分離的組份在柱中顯示了不同的色帶，他稱之為色譜(希臘語)。色譜法因此得名。1907年在德國生物會議上第一次向世界公開展示顯現(xiàn)彩色環(huán)帶的柱管。逐漸應(yīng)用于無色物質(zhì)的分離，“色譜”沿用至今。1930年R.Kuhn用色譜柱分離出胡蘿卜素1935年AdamsandHolmes發(fā)明了苯酚-甲醛型離子交換樹脂，進一步發(fā)明了離子色譜1938年Izmailov發(fā)明薄層色譜

色譜法進展沈昊宇，haoyushen2000@163.com111850年RUNGE的色譜分離過程報告；1905年RAMSEY用色譜法分離氣體；1906年TSWETT發(fā)明了柱色譜；1952年Martin和Synge因開創(chuàng)氣相色譜分析法而獲諾貝爾化學(xué)獎；1956年GOLAY發(fā)明了毛細(xì)管拄；1957年HOLMES將氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用。

12個Nobel獎有關(guān)色譜研究沈昊宇，haoyushen2000@163.com121941年Martin&Synge發(fā)明了液-液分配色譜1944年Consden,Gordon&Martin發(fā)明紙色譜1952年Martin&Synge發(fā)明氣-液色譜1953年Janak發(fā)明氣-固色譜1954年Ray發(fā)明熱導(dǎo)檢測器1957年Martin&Golay發(fā)明毛細(xì)管色譜1959年P(guān)orath&Flodin發(fā)明凝膠色譜1960年液相色譜技術(shù)完善1954年我國研究成功第一臺色譜儀沈昊宇，haoyushen2000@163.com13氣相色譜法(GC)液相色譜法(LC)三、色譜法的分類（一）按兩相狀態(tài)分超臨界流體色譜法(SFC)電色譜沈昊宇，haoyushen2000@163.com14（二）按分離機理分吸附色譜是利用吸附劑對被分離物質(zhì)的吸附能力不同，用溶劑或氣體洗脫，以使組分分離。分配色譜是利用溶液中被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)不同，以使組分分離。其中一相為液體，涂布或使之鍵合在固體載體上，稱固定相；另一相為液體或氣體，稱流動相。離子交換色譜是利用被分離物質(zhì)在離子交換樹脂上的離子交換作用不同而使組分分離。常用的有不同強度的陽、陰離子交換樹脂，流動相一般為水或含有有機溶劑的緩沖液。排阻色譜又稱凝膠色譜或凝膠滲透色譜，是利用被分離物質(zhì)分子量大小的不同和在填料上滲透程度的不同，以使組分分離。常用的填料有分子篩、凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠等，可根據(jù)載體和試樣的性質(zhì)，選用水或有機溶劑為流動相。沈昊宇，haoyushen2000@163.com15（二）按固定相形態(tài)分柱色譜薄層色譜紙色譜沈昊宇，haoyushen2000@163.com16四色譜法的特點（1）分離效率高

復(fù)雜混合物，有機同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高

可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量。（3）分析速度快

一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。（4）應(yīng)用范圍廣

氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

不足之處：

被分離組分的定性較為困難。聯(lián)用技術(shù)發(fā)展可以彌補。

沈昊宇，haoyushen2000@163.com17沈昊宇，haoyushen2000@163.com18

設(shè)疑

如何“看”懂色譜圖？

從色譜圖中如何獲取相應(yīng)檢測結(jié)果的信息？

與光譜圖又有什么區(qū)別？沈昊宇，haoyushen2000@163.com19色譜圖色譜流出曲線基線色譜峰第二節(jié)色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語

色譜圖：色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖，其縱標(biāo)為信號強度，橫坐標(biāo)為保留時間。

一色譜流出曲線沈昊宇，haoyushen2000@163.com20

色譜圖及相關(guān)術(shù)語

前伸峰a、d

拖尾峰b、c

分叉峰e“饅頭”峰f峰底(PeakBase)峰高h(yuǎn)(PeakHeight)峰(底)寬W(PeakWidth)半(高)峰寬W1/2(PeakWidthatHalfHeight)峰面積A

(PeakArea)

峰拐點E、F沈昊宇，haoyushen2000@163.com21

保留值死時間保留時間調(diào)整保留死時間二色譜基本參數(shù)

相對保留值（ris）或選擇因子aa＝

沈昊宇，haoyushen2000@163.com22

從色譜圖中如何獲取相應(yīng)檢測結(jié)果的信息？

根據(jù)峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)。根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析。根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析。色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u價色譜柱分離效能的依據(jù)。色譜峰兩峰間距離，是評價固定相（或流動相）選擇是否合適的依據(jù)。沈昊宇，haoyushen2000@163.com23色譜分析的目的是什么？

設(shè)疑

如何判斷組分分離了？沈昊宇，haoyushen2000@163.com24

分配系數(shù)K一與分離相關(guān)的參數(shù)

分配比（partionradio）k第三節(jié)色譜法基本原理沈昊宇，haoyushen2000@163.com25

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)；選擇適宜的固定相可改善分離效果；每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。

分配系數(shù)K的討論沈昊宇，haoyushen2000@163.com26

在實際工作中，也常用分配比來表征色譜分配平衡過程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時的質(zhì)量比：

1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。

2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。

3.分配比可以由實驗測得。分配比也稱：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；通過調(diào)整保留值可以計算。

分配比k

的討論沈昊宇，haoyushen2000@163.com27

式中β為相比。填充柱相比：6～35；毛細(xì)管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保留時間越長。

容量因子k與分配系數(shù)K的關(guān)系

沈昊宇，haoyushen2000@163.com28分配系數(shù)K、容量因子k與選擇因子(相對保留值)的關(guān)系注意：K或k反映的是某一組分在兩相間的分配；而

是反映兩組分間的分離情況！當(dāng)兩組分K或k

相同時，

=1時，兩組分不能分開；當(dāng)兩組分K或k相差越大時，

越大，分離得越好。

兩組分在兩相間的分配系數(shù)不同，是色譜分離的先決條件。

和k

是計算色譜柱分離效能的重要參數(shù)！沈昊宇，haoyushen2000@163.com29二色譜分離的基本過程沈昊宇，haoyushen2000@163.com30三色譜分離的基本原理

色譜分離的基本原理是試樣組分通過色譜柱時與填料之間發(fā)生相互作用，這種相互作用大小的差異使各組分互相分離而按先后次序從色譜柱后流出。氣-固色譜氣-液色譜溶解－揮發(fā)吸附－脫附兩相及兩相的相對運動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)沈昊宇，haoyushen2000@163.com31

色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標(biāo)及其關(guān)系。兩種色譜理論：塔板理論和速率理論組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜過程的動力學(xué)因素控制；（兩相中的運動阻力，擴散）四色譜理論沈昊宇，haoyushen2000@163.com32

塔板理論的假設(shè)：

(1)在每一個平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到；

(2)將流動相看作成脈動（間歇）過程；

(3)試樣沿色譜柱方向的擴散可忽略；

(4)每次分配的分配系數(shù)相同。塔板理論的提出：

1941年James,Matin提出；半經(jīng)驗理論；將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）；1塔板理論（platetheory）沈昊宇，haoyushen2000@163.com33

色譜柱長：L，虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：

n=L/H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：保留時間包含死時間，在死時間內(nèi)不參與分配!色譜柱效能的參數(shù)：柱效：也叫柱效能。是指色譜柱在分離過程主要由動力學(xué)因素所決定的分離效能，通常用理論塔板數(shù)n或用理論塔板高度H來表示。

沈昊宇，haoyushen2000@163.com34

單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在tM時間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：

有效塔板數(shù)與有效塔板高度沈昊宇，haoyushen2000@163.com35(1)當(dāng)色譜柱長度一定時，塔板數(shù)n

越大(塔板高度H越小)，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。

(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì)。(3)柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。(4)塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實驗結(jié)果，也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。塔板理論的特點和不足沈昊宇，haoyushen2000@163.com362速率理論

1956年荷蘭學(xué)者vanDeemter提出

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，

u：載氣的線速度(cm/s)

減小A、B、C三項可提高柱效；存在著最佳流速；

A、B、C三項各與哪些因素有關(guān)？

速率方程（也稱范.弟姆特方程式）沈昊宇，haoyushen2000@163.com37A─渦流擴散項

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。

空心毛細(xì)管柱：A=0沈昊宇，haoyushen2000@163.com38B/u—分子擴散項

B=2νDgν

：彎曲因子，填充柱色譜，ν<1。

Dg：試樣組分分子在氣相中的擴散系數(shù)（cm2·s-1）

(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴散;(2)擴散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差;(3)分子擴散項與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴散↑;(4)擴散系數(shù)：Dg

∝(M載氣)-1/2；M載氣↑，B值↓。

(5)較低的柱溫可以減小B沈昊宇，haoyushen2000@163.com39減小擔(dān)體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質(zhì)阻力。C·u

—傳質(zhì)阻力項

傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL即：

C=（Cg+CL）沈昊宇，haoyushen2000@163.com40流速高時：

傳質(zhì)阻力項是影響柱效的主要因素，流速

，柱效

。流速低時：

分子擴散項成為影響柱效的主要因素，流速

,柱效

。H-u曲線與最佳流速：

由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。H=A+B/u+C·u

流動相線速度對塔板高度的影響沈昊宇，haoyushen2000@163.com41

固定相粒度越小，塔板高度越小。受線速度影響越小，但流動阻力加大，需采用高壓技術(shù)。（HPLC）

固定相粒度大小對塔板高度的影響氣相色譜：H=B/u+C·u液相色譜：H=A+C·u

氣相色譜與液相色譜法的H-u圖沈昊宇，haoyushen2000@163.com42(1)組分分子在柱內(nèi)運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原因。(2)通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。(4)各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。

小結(jié)：速率理論的要點沈昊宇，haoyushen2000@163.com43

塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對的實際分離程度。即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全分離。難分離物質(zhì)對的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保留值之差──色譜過程的熱力學(xué)因素；區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過程的動力學(xué)因素。色譜分離中的四種情況如圖所示：

討論：①柱效較高，△K(分配系數(shù))較大,完全分離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，△K較大,但分離的不好；④△K小，柱效低，分離效果更差。沈昊宇，haoyushen2000@163.com44R=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%；R=1：分離程度98%；R=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰完全分離的標(biāo)準(zhǔn)）。第四節(jié)分離度與基本色譜分離方程式

分離度的表達(dá)式：沈昊宇，haoyushen2000@163.com45R=1.5R=0.75R=1.0響應(yīng)信號保留時間t,min沈昊宇，haoyushen2000@163.com46

色譜分離方程式：分離度受柱效、選擇因子、容量因子的影響，分離度與三者的關(guān)系為：沈昊宇，haoyushen2000@163.com47

討論：（1）分離度與柱效的關(guān)系

分離度與柱效的平方根成正比，選擇因子一定時，增加柱效，可提高分離度，但組分保留時間增加且峰擴展，分析時間長。R12/R22＝n1/n2=L1/L2（2）分離度與選擇因子的關(guān)系

增大選擇因子是提高分離度的最有效方法，計算可知，在相同分離度下，當(dāng)選擇因子增加一倍，需要的n有效減小10000倍。

一般通過改變固定相和流動相的性質(zhì)和組成或降低柱溫，可增大選擇因子。

增大選擇因子的最有效方法是選擇合適的固定液。沈昊宇，haoyushen2000@163.com48（3）分離度與容量因子的關(guān)系

當(dāng)k>10時，隨容量因子增大，分離度的增長很小。一般k為2-3為宜。對于氣相色譜，通過提高溫度，可選擇合適的k。對于液相色譜，改變流動相的組成，可以有效控制k。

討論：沈昊宇，haoyushen2000@163.com49

分析時間：分析時間通常指最后一個組分出峰的時間。

可見，分析時間與R，，k、H/u等參數(shù)有關(guān)。R增加1倍，分析時間則是原來的4倍。

實際工作中，即要能獲得有效的分離，又要在較短時間內(nèi)完成分析。

分析時間沈昊宇，haoyushen2000@163.com50

在一定條件下，兩個組分的調(diào)整保留時間分別為85秒和100秒，要達(dá)到完全分離，即R=1.5。計算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長是多少？解：a=100/85=1.18

n有效=16R2[a/(a-1)]2=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1547（塊）

L有效=n有效·H有效=1547×0.1=155cm

即柱長為1.55米時，兩組分可以得到完全分離。

例1沈昊宇，haoyushen2000@163.com51

在一定條件下（n=3600，L=1米），兩個組分的保留時間分別為12.2s和12.8s，計算分離度。要達(dá)到完全分離，即R=1.5，所需要的柱長。解：分離度：塔板數(shù)增加一倍，分離度增加多少？

例2沈昊宇，haoyushen2000@163.com52一、色譜定性鑒定方法1.利用純物質(zhì)定性的方法

利用保留值對照定性：通過對比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對比。

利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化。第五節(jié)色譜定性與定量分析Qualitativeandquantitativeanalysisinchromatography沈昊宇，haoyushen2000@163.com532.利用文獻保留值定性

相對保留值r21僅與柱溫和固定液性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊中都列有各種物質(zhì)在不同固定液上的保留數(shù)據(jù)，可以用來進行定性鑒定。

利用相對保留值r21定性

相對保留值沈昊宇，haoyushen2000@163.com54

保留指數(shù)又稱Kovats指數(shù)(Ⅰ)，是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。測定方法：

將正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其保留指數(shù)為分子中碳原子個數(shù)乘以100（如正己烷的保留指數(shù)為600）。其它物質(zhì)的保留指數(shù)（IX）是通過選定兩個相鄰的正構(gòu)烷烴，其分別具有Z和Z＋1個碳原子。被測物質(zhì)X的調(diào)整保留時間應(yīng)在相鄰兩個正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留值之間。

利用保留指數(shù)定性

2.利用文獻保留值定性（續(xù)）沈昊宇，haoyushen2000@163.com553.與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法

色質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS；LC-MS）色譜-紅外光譜儀聯(lián)用儀等；

組分的結(jié)構(gòu)鑒定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD沈昊宇，haoyushen2000@163.com56二、色譜定量分析方法峰面積的測量

（1）峰高（h）乘半峰寬（Y1/2）法：近似將色譜峰當(dāng)作等腰三角形。此法算出的面積是實際峰面積的0.94倍：

A=1.064h·Y1/2

（2）峰高乘平均峰寬法：當(dāng)峰形不對稱時，可在峰高0.15和0.85處分別測定峰寬，由下式計算峰面積：

A=h·（Y

0.15+Y

0.85

）/2

（3）自動積分和微機處理法沈昊宇，haoyushen2000@163.com572.定量校正因子

試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比，即：

mi=fi·Ai絕對校正因子：比例系數(shù)f

i

，單位面積對應(yīng)的物質(zhì)量：

f

i=mi/Ai

定量校正因子與檢測器響應(yīng)值成倒數(shù)關(guān)系：

f

i=1/Si

相對校正因子f

’i

：即組分的絕對校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對校正因子之比。

當(dāng)mi、mS以摩