《動物微生物與免疫》課件-4. 細菌病的實驗室診斷

4.細菌病的實驗室診斷網(wǎng)絡學習資源：下載中國大學慕課app，搜索動物微生物與免疫，參加學習實驗室診斷是在臨床診斷的基礎上進行的注：疑似感染炭疽桿菌死亡的動物尸體嚴禁解剖或剝皮，應立即報告上級防疫部門，嚴格診斷處理。細菌病的實驗室診斷方法一、病料的采集二、病料的保存及運送三、細菌病的實驗室診斷能否成功分離到病原菌病料的采集和運送是關鍵一、病料的采集什么是病料？從得病的動物(多為死后)身上采集的組織或器官，用來進行疾病的研究工作。因此采集病料就要和得病的動物直接接觸一、病料的采集人畜共患?。盒鹿诜窝?、布氏桿菌病、禽流感、狂犬病、沙門氏菌病等很多病原微生物能在環(huán)境中長時間存在思考：為了自身健康和環(huán)境安全，我們在臨床上采集病料時應該注意什么問題？東北農業(yè)大學28名師生感染布氏桿菌病通過觀看視頻，28名師生感染布氏桿菌事件對我們有什么啟示？進行人畜共患傳染病病尸的剖檢時：皮膚：戴手套，穿工作服（防護服）眼睛：有黏膜，因此要帶防護眼罩呼吸道、消化道：要帶口罩，口罩一定要罩住鼻子。防止自身感染：做好個人防護剖檢場所：剖檢前后都應消毒剖檢后的器械、設備進行嚴格消毒動物尸體處理：焚燒、高壓蒸汽滅菌或深埋防止病原散播：做好環(huán)境消毒一、病料的采集病料采集需要遵循哪些原則？無菌采樣適時采樣適當部位適量采樣目的：防止病料被污染方法：—

所有器械和容器必須嚴格滅菌—

注意無菌操作病料采集的原則—無菌采樣細菌豐富增殖時期：取瀕死動物或剛死亡的動物。最好在使用抗生素前采集。病料應該新鮮：死亡動物采集病料夏天不宜遲于6~8h,冬天不遲于24h，否則病料組織可能發(fā)生變性、腐敗。病料采集的原則—適時采樣目的：取含致病菌最多的組織或器官充分了解各種病原菌在患病動物體內的分布情況，有目的地進行采樣根據(jù)疾病的類型和表現(xiàn)采集病變最典型的部位病料采集的原則—適當部位生前有神經(jīng)癥狀的疾?。耗X、脊髓和腦脊液局部性疾?。翰∽儾课坏慕M織如壞死組織、膿腫病灶等敗血癥：血液、肝臟、腎等動物群體：一個動物的樣本量是不夠的，例如對患病雞群進行樣品采集時會采集10只以上?；疾游铮簡蝹€樣本量要足夠，以便在復檢時還有足夠的樣本。病料采集的原則—適量采樣如何對病料進行采集呢？一、病料的采集實質臟器液體材料胃腸道及其內容物病料采集的方法：實質臟器一、病料的采集注：一個容器只裝一個動物的病料，不應把數(shù)個動物的病料混合裝在一起。病料采集的方法：液體材料一、病料的采集體腔液可用注射器吸??；膿汁一般用滅菌的棉棒收集，放入滅菌試管內，塞好棉塞送檢。血液：可無菌操作從靜脈或心臟采血，然后加抗凝劑（檸檬酸鈉）。血清：則采血后放在滅菌的容器中，擺成斜面，待血液凝固析出血清后，再將血清吸出，置于另一滅菌試管中送檢。病料采集的方法：胃腸道及其內容物一、病料的采集腸道：只需選擇病變最明顯的部分，將其中內容物去掉，用滅菌生理鹽水輕輕沖洗后放在平皿內。糞便：應采取新鮮的帶有膿、血、黏液的部分。剪一段兩端扎好的腸管，直接送檢。二、病料的保存及運送冷藏箱液氮罐（-196℃）臨床標本預處理增菌接種培養(yǎng)基，分離單個菌落各種鑒定試驗涂片染色快速診斷試驗生化試驗血清學實驗動物試驗初步診斷，決定是否進行細菌培養(yǎng)最終診斷報告分子生物學技術涂片染色三、細菌病的實驗室診斷1）細菌的形態(tài)檢查：涂片染色三、細菌病的實驗室診斷鏡檢看什么？細菌的有無、數(shù)量、形態(tài)、分布、結構（有無莢膜、芽孢、鞭毛）等，進行初步鑒定1）細菌的形態(tài)檢查：涂片染色三、細菌病的實驗室診斷鏈球菌葡萄球菌1）細菌的形態(tài)檢查：涂片染色三、細菌病的實驗室診斷巴氏桿菌（兩級染色）炭疽芽孢桿菌（如竹節(jié)狀）1）細菌的形態(tài)檢查：涂片染色三、細菌病的實驗室診斷產氣莢膜梭菌（莢膜染色法）破傷風梭菌1）細菌的形態(tài)檢查：涂片染色三、細菌病的實驗室診斷大腸桿菌沙門氏菌1）接種環(huán)是細菌學實驗必需的工具。2）超凈工作臺、無菌室三、細菌病的實驗室診斷2）細菌的接種和分離培養(yǎng)接種工具三、細菌病的實驗室診斷2）細菌的接種和分離培養(yǎng)增菌：方式：增菌培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基：選擇性、非選擇性）病料中病原菌少，或有抗生素殘留時，用固體培養(yǎng)基無法分離出菌落已污染的被檢材料：如飲水、糞便、已腐敗組織等，因含雜菌數(shù)遠超過病原菌，需要增菌培養(yǎng)后再進行分離。平板劃線分離：三、細菌病的實驗室診斷2）細菌的分離培養(yǎng)涂布平板法、傾注平板法：三、細菌病的實驗室診斷2）細菌的分離培養(yǎng)三、細菌病的實驗室診斷2）細菌的分離培養(yǎng)通常選用適合目標菌生長的平板培養(yǎng)基對細菌進行分離培養(yǎng)。

也可采用選擇培養(yǎng)基或鑒別培養(yǎng)基，以起到抑制雜菌或快速鑒別的效果。比如腸道桿菌科可選擇麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂?！?/p>

不同細菌的菌落大小、形態(tài)、色澤、表面特征、邊緣狀態(tài)、隆起度、透明度等特征不同。有的細菌在鮮血瓊脂平板上形成溶血環(huán)。三、細菌病的實驗室診斷2）細菌的分離培養(yǎng)大腸桿菌在伊紅美藍培養(yǎng)基上形成黑色帶金屬光澤的菌落大腸埃希氏菌：邊緣整齊、稍凸起、表面光滑、濕潤的桃紅色菌落，周圍有渾濁膽鹽沉淀圈鼠傷寒沙門氏菌：無色或灰白色菌落，透明或半透明麥康凱瓊脂培養(yǎng)基三、細菌病的實驗室診斷3）細菌的鑒定進行生化試驗的細菌必須是純培養(yǎng)物。通過檢測細菌的代謝產物進行細菌鑒定。例如，腸道菌種類繁多、形態(tài)、染色性和菌落等較為相似，但腸道菌生化反應活潑，可根據(jù)其分解糖和蛋白質的差異進行區(qū)別。檢驗時，根據(jù)可疑細菌的生化特性選擇特定的一組生化試驗，將結果與標準進行對比，以確定病原菌的種類。細菌的生化試驗：IMViC試驗IMViC試驗：吲哚實驗（Indoltest）、甲基紅（MR）實驗、乙二酰（VP）實驗、檸檬酸鹽利用試驗（Citratetest)的合稱縮寫，常用來鑒定腸道桿菌。試驗大腸桿菌吲哚+甲基紅+VP-檸檬酸鹽利用試驗-吲哚實驗甲基紅實驗VP實驗檸檬酸鹽利用試驗IMViC試驗：吲哚實驗吲哚實驗結果IMViC試驗：甲基紅（MR）實驗①試驗菌用葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)24小時。②沿管壁加入甲基紅試劑3-4滴，紅的為陽性，黃的為陰性。甲基紅實驗結果葡萄糖丙酮酸甲酸、乙酸、乳酸等IMViC試驗：乙二酰（VP）實驗VP實驗結果+堿→二乙酰紅色化合物+蛋白胨中精氨酸所含胍基IMViC試驗：檸檬（枸櫞）酸鹽利用試驗VP實驗結果某些細菌能利用培養(yǎng)基中的檸檬酸鈉為唯一碳源而獲得能量，能利用檸檬酸鹽的細菌，也能利用銨鹽作為唯一氮源，分解后生成碳酸鈉和氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。此時培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍指示劑由綠色變?yōu)樯钏{色。三、細菌病的實驗室診斷3）細菌的鑒定體外進行的抗原抗體反應：用已知抗體檢測動物體內的病原菌用已知的病原菌抗原檢測動物血清中的抗體血清學試驗：檢測對象：細菌抗原或細菌的特異性抗體試驗類型：凝集實驗、沉淀試驗等布氏桿菌的檢疫已知未知陽性：塊狀凝集三、細菌病的實驗室診斷3）細菌的鑒定觀察細菌的致病性：動物精神狀態(tài)、體溫、體重和血液變化等；病變和死亡情況測定細菌的毒力：半數(shù)致死量（LD50）細菌的純培養(yǎng)動物接種試驗：將待檢菌液接種到動物體內，觀察動物的發(fā)病情況，進一步確認可疑細菌的致病作用，從而進一步鑒定細菌。三、細菌病的實驗室診斷3）細菌的鑒定動物接種試驗：常用的動物接種途徑：接種對象：本動物OR試驗動物三、細菌病的實驗室診斷3）細菌的鑒定分子生物學技術：基因水平鑒定細菌—PCR診斷技術—核酸雜交技術優(yōu)點（與傳統(tǒng)鑒定方法相比）：靈敏度高：理論上可以檢測出一個細菌簡便快速：2~4h獲得結果對檢測樣品的要求低：不需要活的病原體三、細菌病的實驗室診斷3）細菌的鑒定分子生物學技術：分子生物學技術出現(xiàn)后，傳統(tǒng)的細菌鑒定方法是不是就沒有意義了？三、細菌病的實驗室診斷3）細菌的鑒定分子生物學技術：缺點：無法區(qū)分或細胞和死細胞因靈敏度很高，環(huán)境中存在的抑制劑以及在樣品保存、濃縮和提純過程中所帶來的污染會抑制PCR反應，或是造成假陽性后果，從而影響實驗結果的準確性。三、細菌病的實驗室診斷3）細菌的鑒定分子生物學技術：分子生物學尚不能完全取代傳統(tǒng)微生物技術，還