DB32T 4972.11-2024傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急處置技術規(guī)范 第11部分：細菌類應急檢測技術

CCSC50江蘇省地方標準傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急處置技術規(guī)范第11部分：細菌類應急檢測技術2024-12-27發(fā)布2025-01-27實施江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)發(fā)出布版Ⅰ前言 Ⅲ引言 Ⅳ 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4實驗室生物安全要求 5準備工作和質量控制 6常用顯微鏡檢查技術 7分離培養(yǎng) 8分子生物學應急檢測技術 9免疫學應急檢測技術 參考文獻 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB32/T4972《傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急處置技術規(guī)范》的第11部分。DB32/T4972已經發(fā)布了以下部分：——第1部分：監(jiān)測預警；——第2部分：事件報告和管理；——第3部分：風險評估；——第4部分：現場流行病學調查；——第5部分：恢復評估；——第6部分：應急消毒處置及應急人員個人防護；——第7部分：媒介生物應急監(jiān)測、評估與控制；——第8部分：標本的采集、保存和運輸；——第9部分：應急檢測流程；——第10部分：病毒類應急檢測技術；——第11部分：細菌類應急檢測技術。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會提出并組織實施。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預防控制中心、南京鼓樓醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院、南京農業(yè)大學、中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所、無錫市疾病預防控制中心。Ⅳ引言傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件是江蘇省公共衛(wèi)生安全的主要威脅，對社會、經濟和人群健康存在巨大影響。本文件為貫徹落實《中華人民共和國傳染病防治法》《中華人民共和國突發(fā)事件應對法》《突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急條例》等法律法規(guī)對傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應急處置要求，提升江蘇省傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應急處置能力，保障人民群眾的生命安全和社會穩(wěn)定的目標而制定。DB32/T4972《傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急處置技術規(guī)范》由以下11個部分構成：——第1部分：監(jiān)測預警；——第2部分：事件報告和管理；——第3部分：風險評估；——第4部分：現場流行病學調查；——第5部分：恢復評估；——第6部分：應急消毒處置及應急人員個人防護；——第7部分：媒介生物應急監(jiān)測、評估與控制；——第8部分：標本的采集、保存和運輸；——第9部分：應急檢測流程；——第10部分：病毒類傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急檢測技術；——第11部分：細菌類傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急檢測技術。DB32/T4972的制定是對傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件處置工作相關國家標準、行業(yè)標準的有力補充，為開展傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的監(jiān)測預警、報告和管理、風險評估、現場流行病學調查、恢復評估、應急消毒處置和個人防護、媒介生物的應急監(jiān)測評估與控制、標本的采集和檢測等應急處置工作提供有力的科學依據和技術支撐，對保障公眾健康和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。1DB32/T4972.11—2024傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急處置技術規(guī)范第11部分：細菌類應急檢測技術本文件規(guī)定了細菌類應急檢測的實驗室生物安全要求、準備工作和質量控制、常用顯微鏡檢查技術、分離培養(yǎng)、分子生物學應急檢測技術和免疫學應急檢測技術等。本文件適用于傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急處置中細菌類傳染病病原體的應急檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求WS233病原微生物實驗室生物安全通用準則WS288肺結核診斷3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1致病菌pathogenicbacterium能引起人類疾病的細菌，統稱為致病菌或病原菌。3.2高通量測序high?throughputsequencing可在較短時間內確定目標區(qū)域中核苷酸的順序，用于細菌全基組或病原宏基因測的大規(guī)模并行測序技術。注：又稱“下一代”測序技術（"Next?generation"sequencingtechnology）。4實驗室生物安全要求4.1實驗人員應根據GB19489和風險評估的要求，配備不同類型傳染病感染的個人防護裝備，包括但不限于防護服、手套、外科口罩或醫(yī)用防護口罩、防護面屏、防護帽。防護服宜每隔4h更換一次。在發(fā)生意外暴露時，根據應急處置預案采取必要措施。要求。4.3醫(yī)療廢物處置應按照《醫(yī)療廢物管理條例》規(guī)定執(zhí)行。25準備工作和質量控制5.1準備工作根據實驗需要，選擇相應的生物安全柜、移液器、漩渦震蕩儀、離心機等儀器和檢測試劑耗材。5.2質量控制每一批次反應過程中應至少設置一個陰性和陽性對照，必要時增加空白對照。6常用顯微鏡檢查技術6.1生理鹽水濕片鏡下檢測在玻片上滴加適量生理鹽水，將適量樣本與生理鹽水混合并涂抹均勻后，觀察中性粒細胞、紅細胞及其數量；觀察標本中細菌動力特征（用暗視野顯微鏡觀察）等。6.2革蘭氏染色顯微鏡檢查6.2.1直接在玻片上涂抹標本，涂片應薄且均勻。自然干燥或恒溫干燥器上干燥后，經甲醇固定或火焰快速固定3次，革蘭染色，晾干后讀片。6.2.2革蘭染色脫色時間因選用不同的脫色劑而異。使用革蘭氏染色儀染色，應按照廠家操作說明書進行。6.3抗酸染色顯微鏡檢查抗酸染色鏡檢操作流程應按照WS288執(zhí)行。6.4熒光染色顯微鏡檢查熒光染色顯微鏡檢查步驟如下：a）染色：涂片經火焰固定后，滴加金胺“O”染色劑蓋滿玻片，染色30min，流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水；b）脫色：涂膜上端外緣滴加脫色劑，蓋滿玻片，脫色3min或至無色，流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑；c）復染：加復染劑復染1min，瀝去復染液，流水自玻片一端輕洗，自然干燥后鏡檢；d）鏡檢：玻片涂膜面向上置于熒光或LED顯微鏡載物臺，并以卡尺固定后，以低倍鏡搜索發(fā)現疑為致病菌的熒光物質，使用40×物鏡確認。在暗背景下，目標菌發(fā)出熒光，呈特征形態(tài)。6.5其他特殊染色顯微鏡檢查細菌特殊結構如芽孢、鞭毛、莢膜或其他細菌結構如細胞壁、核質、胞質顆粒等，采用相應的特殊染色法進行顯微鏡檢查。包括且不限于細胞壁染色、鞭毛染色、莢膜染色、芽孢染色、異染顆粒染色。7分離培養(yǎng)7.1無菌部位標本一般應在患者使用抗生素之前采集無菌部位標本如血液標本直接接種血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，陽性血培養(yǎng)3物進行固體培養(yǎng)基分離純化，并進行后續(xù)進一步鑒定，對血培養(yǎng)陰性的標本盲傳一代。7.2非無菌部位標本非無菌部位標本，通過直接培養(yǎng)或選擇性增菌培養(yǎng)的方式，針對不同細菌采用不同培養(yǎng)基和分離程序，得到細菌純培養(yǎng)物。8分子生物學應急檢測技術8.1核酸提取8.1.1試劑盒法提取核酸根據標本類型選擇相應商品化離心柱法或磁珠法基因組核酸提取試劑盒。選擇非人源性內參時，待提取標本中宜加入相應的內參模板。8.1.2常溫一步法提取核酸根據標本類型選擇相應商品化的裂解試劑，將試劑加入標本中，常溫裂解。8.1.3煮沸法提取核酸8.1.3.1標本離心、重懸后使用煮沸法進行簡易模板制備：a）取1接種環(huán)（約2μL~5μL）擴大培養(yǎng)物放入裝有500μL純水或TE的1.5mL離心管內，混勻；d）吸取上清即為PCR模板。8.1.3.2選擇非人源性內參時，在待提取標本中宜加入相應的內參模板。8.2等溫擴增技術8.2.1反應體系配制（引物、鏈置換型核酸合成酶、基質、模板）后置于指定溫度下（60℃~65℃),經一個步驟即可完成。具體參照相應細菌核酸檢測試劑盒說明書。8.2.2陰性對照、陽性對照結果成立時，可使用以下方法進行結果判定：a）濁度檢測：肉眼觀察反應管內出現白色渾濁判定為陽性，未渾濁判為陰性；b）指示劑檢測：加入熒光等指示劑后，根據試劑盒說明書判定結果。8.3實時熒光PCR技術8.3.1反應體系配制（PCR反應液、酶、引物、探針及模板）及反應程序設置（反應溫度、循環(huán)數及熒光通道）應參照相應細菌核酸檢測試劑盒說明書。a）陰性顯示無Ct值、無S形擴增曲線；b）陽性顯示Ct值小于或等于細菌核酸檢測試劑盒說明書規(guī)定值，且有S形擴增曲線。8.4數字PCR技術8.4.1根據PCR儀器和試劑的要求制備反應體系，將體系分配到微小分區(qū)或微滴中并封蓋，進行PCR反應。使用熒光染料或探針監(jiān)測目標核酸的擴增，配套軟件統計分析各反應中的陽性液滴數。8.4.2當陰性對照、陽性對照、內參（如有）結果成立時，進行結果判斷，確定目標核酸及其定量信息，包括4DB32/T4972.11—2024標本中每個熒光通道的濃度、精度、誤差，依據試劑盒說明書進行結果判讀。8.5微流體芯片檢測技術8.5.1參照相應的多病原檢測試劑盒（微流體芯片法）說明書。8.5.2當陰性對照、陽性對照、內參（如有）結果成立時，進行結果判斷，查看各標本擴增曲線的形態(tài)及對應的Ct值，對照試劑盒說明書規(guī)定值進行判讀。8.5.3確定各個病原體靶點陽性擴增所對應的標本編號，報告該標本為對應病原體檢測項目陽性。8.6高通量宏基因組測序8.6.1測序時機傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急檢測中，出現且不限于多病原核酸檢測陰性、分離培養(yǎng)陰性、免疫學檢測陰性等情況時，宜使用宏基因組測序。8.6.2實驗過程對符合要求的核酸進行文庫構建、上機測序、數據分析等。具體反應體系及反應程序參照相應測序平臺及試劑盒說明書，根據應急檢測實際選擇是否執(zhí)行去宿主操作。8.6.3數據處理8.6.3.1數據質量控制數據質量控制要求如下：a）標本經過高通量測序得到的原始數據，應該在去除接頭、低質量數據和宿主基因組序列后再進行下一步分析；b）測序完成后，對Q20和Q30進行統計，標本測序的堿基質量應同時符合：Q201）≥90%、Q302）≥85%；c）每個標本的高質量序列（Q20）數目應大于2×107條，對于宿主含量較多而又未在核酸提取步驟進行去宿主操作的標本，數據量適當增加到4×107~8×107條。注1：測序數據中，堿基識別質量值為20的堿基識別準確率為99%，或錯誤率為1%。注2：測序數據中，堿基識別質量值為30的堿基識別準確率為99.9%，或錯誤率為0.1%。8.6.3.2物種注釋數據質控后對標本數據進行物種注釋，宜選用得到廣泛認可的數據庫進行物種注釋，包括但不限于FoodandDrugAdministrationdAtabaseforReferenceGrademicrObialSequences（FDA?ARGOSWorldDataCentreforMicroorganisms（WDCMGenomeTaxonomyDataBase（GTDB）等。除特殊方法外，對于已知物種，數據庫中序列相似度95%以上，覆蓋度90%以上。8.6.3.3微生物豐度計算數據質控后進行物種相對豐度計算，并記錄計算方法或軟件。除特殊方法外，應將高質量測序數據比對到組裝好的參考基因集或合適的數據庫上，按相似度95%以上，覆蓋度90%以上進行統計，得到基因水平上的相對豐度分布情況，再將注釋到同一物種和同一屬的分類水平的基因序列相對豐度進行疊加，得到種水平和屬水平的相對豐度結果。58.6.4結果判定結果判定規(guī)則如下。a）結合《人間傳染的病原微生物目錄》或其他相關的病原微生物目錄篩選出物種注釋中的致病菌和條件致病菌的信息，針對不同標本類型并結合檢出病原微生物的種類進行解讀，確認致病微傷口）。正常有菌部位應綜合分析檢出細菌是否為導致感染的致病病原。b）對于條件致病菌3）應綜合考慮臨床表現和物種豐度等信息謹慎進行判斷。c）對于致病菌，當種特異性序列數較低時（小于3條）一般不考慮為致病病原，但檢出菌為敏感度較低的菌株，如結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，布魯氏菌，諾卡菌等以及烈性傳染病的時候（包括鼠疫，炭疽等應結合臨床癥狀考慮感染可能，并使用分離培養(yǎng)、涂片染色或抗體檢測等手段予以確認或排除。如果疑似暴發(fā)疫情標本大部分都報告相應序列且能夠排除標本之間或環(huán)境污染時即可認定其為此次疫情的致病菌。d）對于無菌部位檢出病原菌時，在排除標本污染的情況下，高度懷疑其為致病菌。e）對于鑒定出可分離培養(yǎng)的病原菌，應按相應操作指南對原始標本進行分離培養(yǎng)。注：在一定條件下，原來不致病的細菌成為致病菌，稱為條件致病菌或機會致病菌。9免疫學應急檢測技術9.1膠體金檢測技術9.1.1檢測標本的類型、上樣體積及操作步驟參照相應的試劑盒說明書。9.1.2實驗完成后按照試劑盒要求的時間觀察結果，當檢測線和質控線均為陽性結果時，判定對應的檢測項目陽性結果；當質控線為陽性結果，檢測線為陰性結果時，判定對應的檢測項目為陰性結果；當質控線為陰性結果時，判定結果為無效結果，需重復實驗。9.2酶聯免疫吸附實驗（ELISA）9.2.1參照說明依次加入抗原包被（如需要）、待檢標本及對照、酶標記物、底物、終止液，具體流程參照相應細菌ELISA檢測試劑盒說明書。9.2.2以空白對照調零，讀取酶標儀器上各孔450nm和（或）4