轉(zhuǎn)錄組系列講座05轉(zhuǎn)錄因子研究套路課件

轉(zhuǎn)錄因子研究套路酸談學社 套路課

03從課題思路到數(shù)據(jù)細節(jié)全面剖析典型文獻01

功能基因研究套路02

lncRNA

研究套路03

轉(zhuǎn)錄因子研究套路04

外泌體miRNA研究套路05

ceRNA研究套路06

干濕結(jié)合研究套路第

13

節(jié)EMSA實驗第

14

節(jié)ChIP實驗第

15

節(jié)CRISPR-cas9系統(tǒng)（上）第四章 // 實驗技術(shù)相關(guān)講解CHAPTER

4

:

THE

RELATIVE

EXPERIMENTS第

16

節(jié)CRISPR-cas9系統(tǒng)（下）解

螺

旋 | 陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長REFERENCE文獻案例IF=7.519第

13

節(jié)EMSA實驗第

14

節(jié)ChIP實驗第

15

節(jié)CRISPR-cas9系統(tǒng)（上）實驗技術(shù)相關(guān)講解CHAPTER

4

:

THE

RELATIVE

EXPERIMENTS第

16

節(jié)CRISPR-cas9系統(tǒng)（下）EMAS

EXPERIMENTEMAS實驗13標記探針蛋白解

螺

旋|陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長游離探針Shift實驗原理EMAS

EXPERIMENTEMAS實驗13陰性對照常規(guī)反應super-shift反應探針 突變探針冷競爭反應 冷競爭反應標記探針未標記探針未標記的突變探針蛋白抗體游離探針ShiftSuperShift實驗原理解

螺

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醫(yī)

生

科

研

成

長EMAS

EXPERIMENTEMAS實驗13EMSA膠配制EMSA結(jié)合反應電泳EMSA膠配制：4%非變性聚丙烯酰胺凝膠。EMSA結(jié)合反應：設置陰性對照反應、常規(guī)反應、探針冷競爭反應、突變探針反應和Super-shift反應。電泳：預電泳10min后進行正式電泳，注意低溫電泳。轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)NC膜后紫外交聯(lián)。顯色：ECL發(fā)光，掃膜或X光片壓片、洗片。轉(zhuǎn)膜顯色預電泳紫外交聯(lián)解

螺

旋|陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長實驗流程EMAS

EXPERIMENTEMAS實驗13陰性對照常規(guī)反應探針 突變探針冷競爭反應 冷競爭反應super-shift反應游離探針ShiftSuperShift數(shù)據(jù)分析解

螺

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伴

醫(yī)

生

科

研

成

長EMAS

EXPERIMENTEMAS實驗13解

螺

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伴

醫(yī)

生

科

研

成

長得不到陽性結(jié)果：注意實驗設計。受體發(fā)生核轉(zhuǎn)運后到達峰值的時間比較短，多測試幾個時間點。如果用藥物刺激還需要注意藥物滲透和產(chǎn)生細胞因子的過程，時間點可適當延后。核蛋白抽提：使用的核蛋白應保持其天然活性和構(gòu)像。可以用專門的試劑盒抽提，也可以自己配試劑抽提。注意蛋白的濃度和純度，濃度應在1ug/ul以上。探針的制備：EMSA探針長度在30-60bp都可以。優(yōu)先選用文章中的探針序列。優(yōu)先使用生物素標記的探針，兩端都要標記。常見問題第

13

節(jié)EMSA實驗第

14

節(jié)ChIP實驗第

15

節(jié)CRISPR-cas9系統(tǒng)（上）第四章 // 實驗技術(shù)相關(guān)講解CHAPTER

4

:

THE

RELATIVE

EXPERIMENTS第

16

節(jié)CRISPR-cas9系統(tǒng)（下）ChIP

EXPERIMENTChIP

實驗14DNAAgrose

beadsProtein解

螺

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伴

醫(yī)

生

科

研

成

長Antibodycytoplasmnucleus實驗原理ChIP

EXPERIMENTChIP

實驗14甲醛交聯(lián)IP解交聯(lián)核抽提/裂解超聲破碎洗滌DNA純化檢測解

螺

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醫(yī)

生

科

研

成

長甲醛交聯(lián)：1%甲醛室溫交聯(lián)。核抽提和裂解：冰上勻漿，核裂解液室溫裂解。超聲破碎：Bioruptor高功率超聲，具體超聲次數(shù)依組織及細胞類型而定。IP：超聲裂解物中加入Protein

A/G

Plus

beads和抗體及相應的對照IgG進行免疫沉淀。洗滌：先后以不同離子強度的buffer清洗IP后的Protein

A/G

Plus

beads。解交聯(lián)：將蛋白-DNA復合物從beads上洗脫下后進行解交聯(lián)。DNA純化：酚/氯仿法純化DNA。檢測：QPCR或高通量測序。實驗流程ChIP

EXPERIMENTChIP

實驗14數(shù)據(jù)分析解

螺

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醫(yī)

生

科

研

成

長ChIP

EXPERIMENTChIP

實驗14解

螺

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伴

醫(yī)

生

科

研

成

長每個ChIP反應需要多少蛋白？每個ChIP反應大概需要25μg蛋白投入IP?？梢詼y一下蛋白濃度以確認有足夠的蛋白進行IP反應。一定要用ChIP級別的抗體嗎？如果沒有ChIP級抗體（這種抗體還經(jīng)常死貴死貴的），可以嘗試用多抗去進行ChIP。如果沒有合適的多抗，再嘗試使用單抗。每個ChIP反應需要多少抗體？每25μg蛋白，使用3-5μg抗體進行IP，最多可以用到10μg。一定要進行甲醛交聯(lián)嗎？轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合并不牢固，所以最好要使用甲醛把轉(zhuǎn)錄因子與DNA交聯(lián)到一起。如果是做組蛋白ChIP，由于組蛋白與DNA結(jié)合緊密，可以不用交聯(lián)。常見問題第

13

節(jié)EMSA實驗第

14

節(jié)ChIP實驗第

15

節(jié)CRISPR-cas9系統(tǒng)（上）第四章 // 實驗技術(shù)相關(guān)講解CHAPTER

4

:

THE

RELATIVE

EXPERIMENTS第

16

節(jié)CRISPR-cas9系統(tǒng)（下）CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系統(tǒng)（上）15Cas9是個核酸酶，結(jié)合兩個RNA(crRNA,

tracrRNA)就可以切割雙鏈DNA。解

螺

旋|陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長Martin

Jinek,et.al.2012.Science.實驗原理CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系統(tǒng)（上）15Samuel

H.

Sternberg,et.al.

Nature.2014解

螺

旋|陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長實驗原理CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系統(tǒng)（上）15PAM crRNAgRNAtracrRNACas9實驗原理解

螺

旋|陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系統(tǒng)（上）15鑒定混合細胞設計 構(gòu)建gRNA gRNA載體共轉(zhuǎn)染gRNA載體和Cas9載體單克隆 單克隆篩選 鑒定解

螺

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伴

醫(yī)

生

科

研

成

長設計gRNA：選擇位于基因第1或2個外顯子的位置，或者關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域，使用軟件設計gRNA。構(gòu)建gRNA載體：選擇合適的gRNA載體，將化學合成的gRNA

oligo退火后裝入載體。共轉(zhuǎn)染gRNA載體和Cas9載體：將裝有g(shù)RNA的重組載體和Cas9過表達載體共轉(zhuǎn)目的細胞。鑒定混合細胞：取部分轉(zhuǎn)染后的細胞，抽提基因組DNA，endo7酶切鑒定。單克隆篩選：使用藥物加壓結(jié)合極限稀釋等方法篩選單克隆。單克隆鑒定：挑取單克隆擴大培養(yǎng)，取部分細胞抽提基因組DNA，

endo7酶切鑒定和測序鑒定。實驗流程15瓊脂糖凝膠電泳或或變性和退火或T7

Endonuclease

IPCR擴增

雜合 CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系統(tǒng)（上） 數(shù)據(jù)分析雜合 WT雜合WT純合解

螺

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伴

醫(yī)

生

科

研

成

長

WT CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系統(tǒng)（上）15解

螺

旋|陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長選擇什么樣的載體？在addgene上有非常多的載體選擇，還有一些改造過的Cas9蛋白，需要根據(jù)不同的實驗目的來選擇。我在優(yōu)選365中介紹了各種不同的載體以及CRISPR-Cas9技術(shù)的應用供參考。CRISPR-Cas9技術(shù)有脫靶風險嗎？有。野生型的Cas9蛋白編輯效率比較高，但是脫靶風險也高。使用改造過的Cas9n，以doublenickes系統(tǒng)來進行基因敲除能大大降低脫靶風險。一定要篩選單克隆嗎？使用CRISPR-Cas9技術(shù)進行基因敲除的效率并不是百分百的，而且經(jīng)過編輯的細胞其基因的變化情況也各不相同，建議挑選單克隆后再進行后續(xù)實驗。需要像RNA干擾使用多個靶點以說明特異性一樣，使用多個單克隆來進行實驗嗎？建議選擇多個單克隆來進行實驗驗證。常見問題第

13

節(jié)EMSA實驗第

14

節(jié)ChIP實驗第

15

節(jié)CRISPR-cas9系統(tǒng)（上）第四章 // 實驗技術(shù)相關(guān)講解CHAPTER

4

:

THE

RELATIVE

EXPERIMENTS第

16

節(jié)CRISPR-cas9系統(tǒng)（下）CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅡCRISPR-cas9

系統(tǒng)（下）16PAM

crRNAtracrRNAgRNA1Cas9PAM

crRNA解

螺

旋|陪

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醫(yī)

生

科

研

成

長tracrRNAgRNA2實驗原理CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅡCRISPR-cas9

系統(tǒng)（下）16鑒定混合細胞單克隆篩選構(gòu)建gRNA載體設計 共轉(zhuǎn)染gRNA載gRNA

體和Cas9載體單克隆鑒定解

螺

旋|陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長設計gRNA：選擇位于基因第1或2個外顯子的位置，或者關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域，使用軟件設計gRNA。構(gòu)建gRNA載體：選擇合適的gRNA載體，將化學合成的gRNA

oligo退火后裝入載體。共轉(zhuǎn)染gRNA載體和Cas9載體：將裝有g(shù)RNA的重組載體和Cas9過表達載體共轉(zhuǎn)目的細胞。鑒定混合細胞：取部分轉(zhuǎn)染后的細胞，抽提基因組DNA，PCR鑒定。單克隆篩選：使用藥物加壓結(jié)合極限稀釋等方法篩選單克隆。單克隆鑒定：挑取單克隆擴大培養(yǎng)，取部分細胞抽提基因組DNA，

PCR鑒定和測序鑒定。實驗流程CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅡCRISPR-cas9

系統(tǒng)（下）16PCR擴增或瓊脂糖凝膠電泳雜合 WT或雜合WT純合解

螺

旋|陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長數(shù)據(jù)分析CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅡCRISPR-cas9

系統(tǒng)（下）16解

螺

旋|陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長這個系統(tǒng)的編輯效率如何？效率會比單切口的系統(tǒng)低。但是脫靶風險小啊。這個系統(tǒng)為什么能降低脫靶風險？因為該