《酶聯(lián)免疫技術》課件

酶聯(lián)免疫技術酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是一種靈敏度高、特異性強、應用廣泛的免疫學檢測方法。簡介定義酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是一種利用酶標記抗體或抗原的免疫化學檢測方法，通過酶催化底物顯色反應來檢測和定量抗體或抗原。應用ELISA廣泛應用于臨床診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領域，在疾病診斷、藥物研發(fā)、生物制品質量控制等方面發(fā)揮著重要作用。免疫系統(tǒng)的基本概念1免疫系統(tǒng)機體抵抗病原體侵襲的防御體系2免疫器官骨髓、胸腺、脾臟、淋巴結等3免疫細胞淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等4免疫分子抗體、抗原、細胞因子等免疫球蛋白的結構和分類1結構由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，具有可變區(qū)和恒定區(qū)2分類IgG、IgM、IgA、IgD、IgE3功能識別抗原，激活免疫效應細胞，清除病原體抗原-抗體反應的基本原理抗原能與免疫系統(tǒng)中的抗體或T細胞受體結合的物質抗體由免疫細胞產(chǎn)生的，能特異性識別并結合抗原的蛋白質反應特點特異性、可逆性、親和性應用診斷、治療、疫苗研發(fā)等酶聯(lián)免疫檢測技術的發(fā)展歷程11960s免疫熒光技術發(fā)展21971年Engvall和Perlmann首次報道ELISA技術31980sELISA技術應用于臨床診斷41990sELISA技術應用于食品安全和環(huán)境監(jiān)測52000sELISA技術與其他技術結合，發(fā)展新的檢測方法酶聯(lián)免疫檢測技術的基本原理1抗原-抗體結合抗體或抗原被固定在固相載體上，形成固相抗體或抗原2酶標記抗體用酶標記抗體，與固相抗原或抗體反應3顯色反應加入酶的底物，酶催化底物發(fā)生顏色變化4結果判斷根據(jù)顏色變化的程度判斷樣本中抗體或抗原的含量酶聯(lián)免疫技術的主要類型直接法ELISA用酶標記的抗體直接與抗原反應間接法ELISA用酶標記的抗抗體與與抗原結合的抗體反應競爭性ELISA加入已知濃度的酶標記抗原與待測抗原競爭結合抗體夾心式ELISA用兩種抗體夾住待測抗原，形成抗體-抗原-抗體的復合物直接法ELISA固相抗原將待測抗原固定在固相載體上酶標記抗體加入酶標記的抗體，與抗原反應顯色反應加入酶底物，觀察顏色變化間接法ELISA固相抗原將待測抗原固定在固相載體上待測抗體加入待測抗體，與抗原反應酶標記抗抗體加入酶標記的抗抗體，與抗體反應顯色反應加入酶底物，觀察顏色變化競爭性ELISA固相抗體將已知濃度的抗體固定在固相載體上待測抗原加入待測抗原與酶標記的抗原競爭結合抗體顯色反應加入酶底物，觀察顏色變化結果分析待測抗原濃度與顯色程度呈負相關夾心式ELISA固相抗體1將特異性抗體1固定在固相載體上待測抗原加入待測抗原，與抗體1反應酶標記抗體2加入酶標記的抗體2，與抗原反應顯色反應加入酶底物，觀察顏色變化酶聯(lián)免疫檢測技術的樣品制備樣品類型血清、血漿、尿液、組織、細胞等制備方法離心、沉淀、過濾、提取等，去除干擾物質注意事項樣品處理要規(guī)范，避免污染，保證樣品質量酶聯(lián)免疫檢測技術的檢測步驟1包被抗原或抗體將待測抗原或抗體固定在固相載體上2封閉用封閉液封閉固相載體上的空位，減少非特異性結合3加入樣品加入待測樣品，與固相抗原或抗體反應4加入酶標記抗體加入酶標記的抗體，與抗原或抗體反應5洗滌洗去未結合的物質6加入底物加入酶的底物，酶催化底物發(fā)生顏色變化7測定結果用酶標儀或分光光度計測定顏色變化，計算結果酶聯(lián)免疫檢測技術的定量分析1標準曲線用已知濃度的標準品制作標準曲線2樣本測定測定樣本的吸光度值3結果分析根據(jù)標準曲線，確定樣本中抗原或抗體的濃度酶聯(lián)免疫檢測技術的應用領域臨床診斷傳染病診斷檢測病毒、細菌、寄生蟲等病原體抗體或抗原自身免疫病診斷檢測自身抗體，輔助診斷自身免疫性疾病腫瘤標志物檢測檢測腫瘤標志物，輔助診斷腫瘤環(huán)境監(jiān)測水質檢測檢測水體中的細菌、病毒、農(nóng)藥殘留等污染物空氣質量檢測檢測空氣中的細菌、病毒、污染物等土壤檢測檢測土壤中的農(nóng)藥殘留、重金屬等污染物食品安全檢測食品添加劑檢測檢測食品中是否添加了違禁添加劑肉類安全檢測檢測肉類中的激素、抗生素等殘留乳制品安全檢測檢測乳制品中的抗生素、農(nóng)藥殘留等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)檢測病蟲害檢測檢測植物病蟲害，及時防治動物疫病檢測檢測動物疫病，預防疫情爆發(fā)農(nóng)產(chǎn)品質量檢測檢測農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留、重金屬等，保證食品安全酶聯(lián)免疫檢測技術的優(yōu)勢和局限性優(yōu)勢靈敏度高、特異性強、操作簡便、成本低廉、應用廣泛局限性檢測時間較長，可能受到樣品質量、操作因素的影響，某些情況下靈敏度不足靈敏度和特異性靈敏度檢測方法識別陽性樣品的準確率特異性檢測方法識別陰性樣品的準確率檢測時間和成本檢測時間傳統(tǒng)ELISA方法需要數(shù)小時，新型ELISA方法可縮短至數(shù)十分鐘成本ELISA方法成本相對較低，適合大規(guī)模檢測操作復雜性操作步驟ELISA方法操作步驟較多，需要嚴格的實驗操作人員要求需要具備一定的專業(yè)知識和技能臨床應用的局限性交叉反應抗體或抗原可能與其他物質發(fā)生交叉反應，導致假陽性結果干擾因素樣品質量、操作因素等可能影響檢測結果靈敏度不足在某些情況下，ELISA方法的靈敏度不足以檢測微量抗原或抗體酶聯(lián)免疫檢測技術的發(fā)展趨勢1新型檢測平臺的開發(fā)微流控芯片、納米材料等新技術應用于ELISA檢測2多重檢測和自動化技術發(fā)展多重ELISA檢測方法，提高檢測效率3分子診斷與融合技術ELISA技術與分子診斷技術結合，提高檢測精度和靈敏度新型檢測平臺的開發(fā)微流控芯片將ELISA反應縮小到微米尺度，提高檢測效率和靈敏度納米材料納米材料具有高表面積、生物相容性等優(yōu)點，可用于增強ELISA檢測信號多重檢測和自動化技術多重ELISA檢測在一個反應體系中同時檢測多種抗原或抗體自動化技術開發(fā)自動化ELISA檢測系統(tǒng)，提高檢測速度和準確性分子診斷與融合技術PCR技術將ELISA技術與PCR技術結合，提高檢測靈敏度基因測序技術將ELISA技術與基因測序技術結合，實現(xiàn)精準診斷結語酶聯(lián)免疫技術是一種簡單、快速、高效的檢測方法，在醫(yī)學、生物、食品等領域發(fā)揮著重要作用?？偨Y本課程內(nèi)容1