《軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)》（征求意見(jiàn)稿）

4T/CITSXXXXX.X—2024軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)2規(guī)范性引用文件3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1人間充質(zhì)干細(xì)胞humanmesenchymalstemcell，hMSC3.2完全培養(yǎng)基completemedium4符號(hào)和縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文。FBS：胎牛血清（Fetalbovineserum）MEM：最小必需培養(yǎng)基（MinimumEssentialMedium）NEAA：非必需氨基酸（Non-essentialaminoacid）MSC：間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymalstemcell）5實(shí)驗(yàn)環(huán)境6儀器與耗材5T/CITSXXXXX.X—20246.1二級(jí)生物安全柜。6.2熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。6.3低速離心機(jī)。6.4分析天平。6.5純水儀。6.6高壓滅菌鍋。6.7水浴鍋。6.8CO2培養(yǎng)箱。6.9微量移液器：10μl、100μl、200μl、1000μl。6.10倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)。6.112℃~8℃醫(yī)用冷藏冰箱。6.12藥匙、稱(chēng)量紙、量筒、三角瓶。6.13無(wú)菌吸頭：10μl、100μl、200μl、1000μl。6.14無(wú)菌移液管：5ml、10ml、25ml。6.15無(wú)菌離心管：1.5ml、15ml、50ml。6.16細(xì)胞計(jì)數(shù)板6.17無(wú)菌六孔板。7試劑7.1低熔點(diǎn)瓊脂糖。7.2MSC細(xì)胞培養(yǎng)基。7.3MEM培養(yǎng)基。7.4FBS。7.5MEMNEAA。7.6丙酮酸鈉。7.7谷氨酰胺。7.8AO/PI染液。8實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞8.1陰性對(duì)照用細(xì)胞6T/CITSXXXXX.X—2024推薦使用MRC-5細(xì)胞系。來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，保存取用按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。8.2陽(yáng)性對(duì)照用細(xì)胞推薦使用HeLa細(xì)胞系，或經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的永生化細(xì)胞。來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，保存取用按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。8.3待檢細(xì)胞hMSC。9實(shí)驗(yàn)分組表1實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)表33333無(wú)無(wú)10操作步驟10.1溶液配制10.1.15%瓊脂糖（以10ml為例）：用分析天平稱(chēng)量0.5g低熔點(diǎn)瓊脂糖干粉，加入10ml超純水，混勻，121℃滅菌15min。滅菌完成后，熱水浴保持瓊脂糖溶液不凝固。10.1.2MEM完全培養(yǎng)基（以100ml為例無(wú)菌條件下按照表2配制，混勻后置于37℃?zhèn)溆?。?MEM完全培養(yǎng)基成分表7T/CITSXXXXX.X—202410.2細(xì)胞處理10.2.3.1陰性對(duì)照組：MRC-5，10.2.3.2陽(yáng)性對(duì)照組：HeLa，用MEM完全培養(yǎng)基調(diào)整活細(xì)胞濃度至1×103cells/ml。10.3鋪板及細(xì)胞接種（每組）自然冷卻至凝固，或密封后置于2℃~8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0.4培養(yǎng)平板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21d。