(高清版)DB21∕T 2451-2015 玉米品種真實(shí)性鑒定 SSR分子檢測(cè)方法

玉米品種真實(shí)性鑒定SSR分子檢測(cè)方法205-C4-O發(fā)布2015-6-O1實(shí)施遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I前言 1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ) 14方法原理 25儀器設(shè)備、試劑和溶液配制 26檢測(cè)步驟 37結(jié)果分析和表示 68結(jié)果判定 6附錄A(規(guī)范性附錄)核心引物名稱(chēng)和序列 7附錄B(規(guī)范性附錄)溶液配制 9本標(biāo)準(zhǔn)按照ET1.1-20哈出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省農(nóng)村經(jīng)濟(jì)委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省種子管理局。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：朱志成、李波、高振環(huán)、鄒暢、肖國(guó)峰、王汝寶、李洪建、趙前程、王見(jiàn)中、溫浩、李鵬、史鴻儒、安輝、徐策、孫麗紅、王東坡。11范圍件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。BT35432農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)31術(shù)語(yǔ)和定義32縮略語(yǔ)2CTAB:cetyltrimethylammoniumbromide,十DNA:deoxyribonucleicacid,脫氧核糖核酸。dNTPs:deoxyribonucleosidetriphSDS:sodiumdodecylsulfate,十二烷基苯磺酸鈉。SSR:simplesequence4方法原理5儀器設(shè)備、試劑和溶液配制51.2毛細(xì)管電泳檢測(cè)平臺(tái)52試劑CAB三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙二胺四乙酸二鈉(EDTANy2H0、三羥甲基氨基甲烷(Trisbace)、37%的鹽酸、氫氧化鈉(NEOH、氯化鈉(NC)、dNTPs.Taq(bisaoryaide)、丙烯酰胺(arylaide)、硼酸(BricAid、尿素、親和硅烷(BndrgSlare)、疏水硅烷(RepeSlare)、DA分子量標(biāo)準(zhǔn)、無(wú)水乙醇、四甲基乙二胺(TEND、過(guò)硫酸銨(AS)、CAB三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙二胺四乙酸二鈉(DTANay2-0、三羥甲基氨基甲烷(Trisbae)、3%的鹽酸、53溶液配制3DB2V/T2DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳以及銀染溶液按照附錄B(規(guī)范性附錄)規(guī)定的要求6檢測(cè)步驟61送驗(yàn)樣品及DNA提取送驗(yàn)樣品為種子，重量不低于2mg或不少于5D粒。送驗(yàn)樣品為果穗，應(yīng)不低于5個(gè)果穗(總粒數(shù)不低于5D粒);送驗(yàn)樣品為幼苗、葉片或苞葉的，應(yīng)至少含有40個(gè)個(gè)體。移入20rt離心管。每管加入TOIL經(jīng)65C預(yù)熱的CAB提取液，充分混勻，65C水浴60in充分混勻。每管加入等體積的三氯甲烷/異戊醇(241)混合液，充分混合后靜置10in在120p條件下后在4C、120Drpm條件下離心10in棄上清液，加入TO6醇溶液，旋轉(zhuǎn)2次后棄去乙醇溶液，并倒立于墊有濾紙的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，室溫放置10rin以上。加入10L超純水或正緩沖液1,充分溶解后備3OLSDS提取液，混勻后在100pm條件下離心2in吸取上清液，轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有3OL異丙醇E緩沖液1,充分溶解后備用。61.23堿煮法孔板中。每孔加入15QL氫氧化鈉溶液，煮沸Sin然后加入15QLE緩沖液2充分溶解后備用。61.24試劑盒法462PCR擴(kuò)增單引物電泳。選用毛細(xì)管電泳，合成引物時(shí)需在上游引物的5端標(biāo)記熒光染料，可采用單引物電泳或原濃度終濃度體積(μL)一22引物263擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)取10b4BBAE膠，加入TEND631.2變性5DB2V/T2a)正極槽(下槽)加入1×TE緩沖液60b負(fù)極槽(上槽)加入經(jīng)65C預(yù)熱的1×T任緩沖液60tb用移液器清除加樣槽孔氣泡和雜質(zhì)，插入樣品梳(鯊魚(yú)齒朝下),每一個(gè)加樣孔點(diǎn)入5L樣品d達(dá)到電泳時(shí)間后關(guān)閉電源，結(jié)束電泳，取下玻璃板并輕輕撬開(kāi)，通常凝膠附著在無(wú)凹槽的玻璃板上。631.4染色將膠板放入顯影液中，輕輕晃動(dòng)待條帶清晰后取632熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)用孔板孔中，各孔再分別加入O1μL分子量?jī)?nèi)標(biāo)和89μL去離子甲酰胺。在PR儀上另℃變性5in打開(kāi)DN分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)，更換緩沖液、灌膠。將裝有樣品的微孔板放置于樣品架基座件。67結(jié)果分析和表示位點(diǎn)差異記錄分為下列三種情形：——位點(diǎn)存在差異的或完全相同的，記錄為有差異或無(wú)差異；——位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失的，記錄為缺失；——位點(diǎn)顯示無(wú)法判定的，記錄為無(wú)法判定。檢驗(yàn)結(jié)果用比較供檢樣品和對(duì)照樣品的位點(diǎn)差異數(shù)目表示。統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)差異記錄的結(jié)果，計(jì)算比較位點(diǎn)數(shù)、差異位點(diǎn)數(shù)及差異位點(diǎn)。供檢樣品和對(duì)照樣品的差異位點(diǎn)數(shù)目≥3,判定為與對(duì)照樣品不相符。供檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的差異位點(diǎn)數(shù)目<3判定為與對(duì)照樣品相符。屬于下列情形之一的，需要在檢驗(yàn)報(bào)告中注明：——采用的對(duì)照樣品數(shù)據(jù)來(lái)自對(duì)照樣品DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的；——使用特異引物進(jìn)行檢測(cè)的，應(yīng)提供該特異引物的序列信息。7編號(hào)引物名稱(chēng)分組引物序列熒光染料I上游：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC下游：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTCII下游：GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACACI上游：CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCC下游：GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCCI下游：ATGGACTCTGTGCGACI上游：CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG下游：TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGCI上游：GCTCGTCTCCTCCAGGTCAGGI上游：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG下游：CATAACCTTGCCTCCCAAACCCI上游：GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG下游：CACGTACGGCAATGCAGACAAGII下游：GATGGATGGAGCATGAGCTTGCI上游：GATCCGCATTGTCAAATGACCACI上游：AATGCCGTTATCATGCGATGC下游：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGTII上游：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC下游：GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATACI下游：TTGATGGGCACGATCTCGTAGTCI下游：GGACCCAGACCAGGTTCCACCI上游：GCGGAAGAGTAGICGTAGGGCTAGIGTAG下游：AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGGI下游：GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGCI下游：TTCAGTCGAGCGCCCAACACⅡ上游：AAGAACAGGACTACATG下游：GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGCⅡ8Ⅱ下游：CCATCTGCTGATCCGAATACCCⅡ上游：TGATAGGTAGTTAGCATAT下游：GAGCATAGAAAAAGTTGAGGTTAATATGGAGCⅡ上游：CACTCTCCCTCTAAAATATCAGACAACACC下游：GCTTCTGCTGCTGTTTTGTTCTTGⅡ上游：GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTC下游：GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGTⅡⅡ上游：GGCCACGTTATTGCTCATTTGCⅡ下游：GGGTTTCACCAACGGGGATAGGⅡ上游：CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC下游：GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTGⅡⅡ上游：AGCAAGCAGTAGGTGGAGGAAGG下游：AGCTGTTGTGGCTCTTTGCCTGTⅡ上游：TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG下游：CTGTGCTCGTGCTTCTCTCTGAGTATTⅡ下游：TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTCⅡ上游：CGCACGGCACGATAGAGGTG下游：AACTGCTTGCCACTGGTACGGTCTⅡ下游：CAGTAGCCCCTCAAGCAAAACATTCⅡ上游：ACTGATCGCGACGAGTTAATTCAAAC下游：TACCGAAGAACAACGTCATTTCAGCⅡ下游：GGCACTCAGCAAAGAGCCAAATTCⅡ下游：TGGACGCGAACCAGAAACAGACⅡ上游：CAAGCGGGAATCTGAATCTTTGTTC下游：CTTCGTACCATCTTC