《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段》學(xué)習(xí)要點

4/4課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1、通過嘗試PCR技術(shù)的基本操作，使學(xué)生體驗PCR這一常規(guī)的分子生物學(xué)試驗方法。2、通過觀看PCR相關(guān)視頻,結(jié)合教師講解,能夠理解PCR的原理，討論PCR的應(yīng)用?！緦W(xué)習(xí)重、難點】重點：PCR的原理和PCR的基本操作難點：PCR的原理【學(xué)習(xí)要點梳理】要點1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。要點2PCR原理（1）在用PCR技術(shù)擴增DNA時，DNA的復(fù)制過程與細胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似．細胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種成分和基本條件以及各自的作用如下表：參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（2）DNA的方向通常將DNA的羥基(－OH)末端稱為3’端，而磷酸基團的末端稱為5’端。（3）引物引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對。用于PCR的引物長度通常為20～30個核苷酸。引物的作用：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從引物的3'端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。（4）DNA的合成方向當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3’端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸。（5）DNA的變性與復(fù)性在80-100℃（6）PCR對DNA雙鏈的解聚與結(jié)合控制PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。（7）TaqDNA聚合酶的應(yīng)用PCR中的高溫會導(dǎo)致普通DNA聚合酶失活，而耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了這個問題，大大增加了PCR的效率，使PCR技術(shù)趨向自動化。（8）PCR擴增DNA的基本條件PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中提供：DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物。四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行。要點3PCR的反應(yīng)過程PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進行DNA的延伸。這樣，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。要點4實驗操作做PCR通常使用微量離心管，它是一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5mL。具體操作時，用微量移液器向微量離心管中依次加入各組分，再設(shè)計好PCR儀的循環(huán)程序就可以了。如果沒有PCR儀，可以設(shè)置3個恒溫水浴鍋，溫度分別為94℃、55℃和PCR的突出優(yōu)點是快速、高效、靈活和易于操作。要點5DNA含量的測定DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰(見下圖)?？梢岳肈NA的這一特點進行DNA含量的測定。具體步驟如下：（1）將樣品進行50倍稀釋：取2LPCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水。（2）以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。（3）加入步驟1中的DNA稀釋液100L至比色杯中，測定260nm處的光吸收值。（4）計算DNA含量。公式：DNA含量(g)=50×（260nm的讀數(shù)）×稀釋倍數(shù)。要點6實驗注意事項（1）為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓蒸汽滅菌。（2）在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入